Κύριος

Το πεδίο της έρευνας του περιβαλλοντικού DNA (eDNA) επεκτείνεται ταχέως τα τελευταία χρόνια, με αποτέλεσμα την άνευ προηγουμένου πρόοδο σε μια σειρά εφαρμογών βιολογικής παρακολούθησης. 

Η περιβαλλοντική έρευνα DNA παρέχει μια μη επεμβατική και οικονομικά αποδοτική προσέγγιση για τη μελέτη και τη διαχείριση άγριων πληθυσμών και χωροκατακτητικών ειδών, χρησιμοποιώντας μια ιατροδικαστική προσέγγιση για την εξαγωγή και την αναγνώριση θραυσμάτων DNA που απελευθερώνονται καθώς οι οργανισμοί ταξιδεύουν και αλληλεπιδρούν με το περιβάλλον 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . 

Η ανάλυση του περιβαλλοντικού DNA εφαρμόζεται επίσης σε θέματα υγείας του ανθρώπου και των ζώων — για παράδειγμα, στην παρακολούθηση παθογόνων παρασίτων και γύρης 1, 8 , 9 , 10 . Αυτό περιλαμβάνει το ταχέως αναδυόμενο πεδίο ανίχνευσης παθογόνων που βασίζεται σε ανθρώπινο eDNA από ανθρώπινα λύματα. 

Τέτοιες προσεγγίσεις αναπτύχθηκαν γρήγορα κατά τα πρώτα στάδια της πανδημίας COVID-19 και έχουν ήδη επαναχρησιμοποιηθεί για άλλα παθογόνα όπως η ευλογιά των πιθήκων, ο ιός της πολιομυελίτιδας και η φυματίωση 1 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . 

Το περιβαλλοντικό DNA έχει ληφθεί με επιτυχία από μια σειρά τύπων δειγμάτων, όπως αέρα, έδαφος, χερσαία και υδάτινα ιζήματα, νερό (θαλάσσιο, γλυκό νερό και λύματα), μόνιμο πάγο, χιόνι και πυρήνες πάγου 10 , 16 , 17 .

Η περιβαλλοντική έρευνα DNA βασιζόταν παραδοσιακά κυρίως σε στοχευμένες μεθοδολογίες, όπως η ποσοτική PCR (qPCR) και η αλληλουχία επόμενης γενιάς που βασίζεται σε μεταγραμμικό κώδικα, καθώς και οι πρώιμες εφαρμογές εστιασμένες σε βακτηριακές κοινότητες 18 . 

Ωστόσο, οι συνεχείς βελτιώσεις στην τεχνολογία βαθιάς αλληλουχίας και οι νέες βελτιώσεις στη βιοπληροφορική σημαίνουν ότι οι μη στοχευμένες προσεγγίσεις που βασίζονται σε αλληλουχία κυνηγετικών όπλων γίνονται εφικτές (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 1α ) , οι οποίες αποτυπώνουν πληρέστερα την πραγματική έκταση της γενετικής ποικιλότητας σε ένα δείγμα 1 , 8 , 19. 

Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων πρόκειται να γίνει πιο αποδοτική από πλευράς εργασίας και κόστους από την qPCR ή τη μεταγραμμική κωδικοποίηση στο εγγύς μέλλον, παρέχοντας παράλληλα τις λιγότερο προκατειλημμένες αξιολογήσεις βιοποικιλότητας, παρέχοντας έτσι την ευρύτερη δυνατή πληροφόρηση παρουσίας και αφθονίας σε όλα τα taxa. 

Πρόσφατα δείξαμε ότι η μη στοχευμένη βαθιά αλληλουχία κυνηγετικών όπλων (η άμεση αλληλούχιση του συνολικού eDNA χωρίς προηγούμενο εμπλουτισμό ή επιλογή) μπορεί να παρέχει δεδομένα αλληλουχίας ξενιστή και παθογόνου 8 , 17 , ενώ ταυτόχρονα συλλαμβάνει όλη την άλλη βιοποικιλότητα σε ένα περιβαλλοντικό δείγμα.

 Παρόμοια με τις αξιολογήσεις βιοποικιλότητας, η αλληλουχία των δειγμάτων λυμάτων θα μπορούσε να εφαρμοστεί για την παρακολούθηση όλων των ανθρώπινων παθογόνων παραγόντων ταυτόχρονα, αλλά πιθανότατα θα συλλάβει επίσης μεγάλο όγκο δεδομένων ανθρώπινου γονιδιώματος.

Ενώ υπάρχει πληθώρα ευεργετικών εφαρμογών του eDNA, υποθέτουμε ότι μια ακούσια αρνητική συνέπεια των προσεγγίσεων του eDNA μπορεί να είναι η σύλληψη ανθρώπινων γονιδιωματικών πληροφοριών (ανθρώπινο γενετικό παρεμπίπτον αλίευμα (HGB)· Εικ. 1α). Μπορούν επίσης να προβλεφθούν ευεργετικές εφαρμογές δειγματοληψίας eDNA με επίκεντρο τον άνθρωπο. 

Επί του παρόντος, το ανθρώπινο DNA είναι σπάνια (αν ποτέ) ο επιδιωκόμενος στόχος των μελετών eDNA, αφήνοντας το πεδίο με έλλειψη συγκεκριμένων ρυθμιστικών κατευθυντήριων γραμμών ή ηθικών εγκρίσεων που σχετίζονται με τον άνθρωπο. 

Οι τρέχουσες στοχευμένες προσεγγίσεις eDNA που βασίζονται σε qPCR και μεταγραμμικό κώδικα δεν ανακτούν σημαντικές πληροφορίες για το ανθρώπινο γονιδίωμα. 

Ωστόσο, καθώς το eDNA μετατοπίζεται προς τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του κυνηγετικού όπλου, θα ανακτηθούν δυνητικά μεγάλοι όγκοι ανθρώπινου eDNA, συμπεριλαμβανομένων επαρκών δεδομένων για την αναγνώριση και τον προσδιορισμό φαινοτύπων ανθρώπινων ατόμων. 

Η λήψη γενετικών δεδομένων από ταυτοποιήσιμα άτομα απαιτεί ενημερωμένη συγκατάθεση 20. Τα νομικά και δεοντολογικά πλαίσια είναι κοινά σε μελέτες που αφορούν ανθρώπους και μελέτες που δημιουργούν δεδομένα ασθενών, αν και με συνεχή συζήτηση σχετικά με το εάν τέτοιες πολιτικές είναι επαρκώς αυστηρές σε σχέση με τη συναίνεση κατόπιν ενημέρωσης, την ιδιοκτησία και την προστασία δεδομένων 20 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Εικ. 1: Ανάκτηση ανθρώπινου eDNA από δείγματα πεδίου.
Φιγούρα 1

α , Σχηματική επισκόπηση του τρόπου με τον οποίο το ανθρώπινο DNA μπορεί να εισέλθει στο περιβάλλον και να προσδιοριστεί κατά λάθος η αλληλουχία του ως HGB από μελέτες eDNA που εστιάζονται σε παθογόνα και άγρια ​​ζώα. Σχηματικό που δημιουργήθηκε με το BioRender. 

β , Η ευθυγράμμιση ολόκληρου του ανθρώπινου γονιδιώματος διαβάζει από μια μελέτη αλληλουχίας του όπλου Illumina με κυνηγετικό όπλο άγριας φύσης. 

c , ποσοτικοποίηση του ανθρώπινου eDNA με βάση το qPCR ανά είδος από δειγματοληψία νερού του ποταμού Avoca. Εμφανίζεται η απόλυτη ποσότητα (0,1 ng ανά μl ανά αντίδραση) ανθρώπινου eDNA ανά δείγμα. Κάθε αντίδραση qPCR είναι μια αντίδραση 10 μl που περιέχει 1 μl εκχυλισμένου προτύπου eDNA. Τα δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν με LILRB2 ειδικές για τον άνθρωπο δοκιμασίες. 

Για όγκους φιλτραρισμένου νερού και όγκους έκλουσης, βλέπε Συμπληρωματικό Πίνακα 2 . 

Για αντιστοίχιση δειγμάτων ποσοτικοποιημένα μεΕιδικές για τον άνθρωπο δοκιμασίες ZNF285 , βλέπε Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1γ . 

Τα μουστάκια Tukey (εκτείνονται σε σημεία δεδομένων που απέχουν λιγότερο από 1,5 × διατεταρτημόριο εύρος (IQR) από το 1ο/3ο τεταρτημόριο) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τεταρτημόριο. 

Η διάμεσος για κάθε δείγμα εμφανίζεται ως οριζόντια γραμμή μέσα σε κάθε κουτί και οι άκρες του κιβωτίου είναι τα άνω και κάτω τεταρτημόρια. 

Ένα πλαίσιο απεικονίζεται γραφικά ανά μεμονωμένο δείγμα, που αποτελείται από όλα τα τεχνικά αντίγραφα φρεατίων qPCR για αυτό το δείγμα. 

Τα βιολογικά αντίγραφα δεν συγκεντρώνονται σε κανένα κουτί, με κάθε δείγμα να δηλώνεται με το δικό του κουτί.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Για να εξακριβώσουμε εάν το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA θα μπορούσε να συλλεχθεί από δεδομένα eDNA, ευθυγραμμίσαμε τα δεδομένα αλληλουχίας που είχαν δημιουργηθεί προηγουμένως 8 , 17 ως μέρος των έργων μας eDNA άγριας ζωής και παθογόνου έναντι του ανθρώπινου γονιδιώματος αναφοράς. 

Έχοντας αποδείξει την εμφάνιση της HGB, εφαρμόσαμε στη συνέχεια qPCR συγκεκριμένου είδους για να ποσοτικοποιήσουμε το επίπεδο του ανθρώπινου eDNA σε δείγματα περιβαλλοντικού νερού από τοποθεσίες μακριά και κοντά στην ανθρώπινη κατοικία, από ανθρώπινα ίχνη στην άμμο παραλίας και από κατειλημμένο και μη κατειλημμένο αέρα δωματίου (Συμπληρωματικό Εικ. 1 ). 

Τέλος, εφαρμόσαμε αλληλουχία μακράς ανάγνωσης κυνηγετικού όπλου και εμπλουτισμό ανθρώπινων εξωμάτων με αλληλουχία σύντομης ανάγνωσης για να λάβουμε αλληλουχίες ευθυγράμμισης ανθρώπου για την ανακατασκευή πληροφοριακών ανθρώπινων απλοτύπων (γενετική καταγωγή και μεταλλάξεις) από το eDNA.

Αποτελέσματα

Οι αναγνώσεις ευθυγράμμισης του ανθρώπου ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα (Εικ. 1β και Συμπληρωματικός Πίνακας 1 ) μη στοχευμένης αλληλουχίας σε βάθος κυνηγετικού όπλου από το νερό και την άμμο eDNA που δημιουργήθηκε για την παρακολούθηση άγριας ζωής και παθογόνων 8 , 17 . 

Επιπλέον, σε ορισμένα δείγματα άγριου (χωρίς δεξαμενή αποκατάστασης) νερού, ανιχνεύθηκαν μετρήσεις ευθυγράμμισης του ανθρώπου σε επίπεδα σχεδόν τόσο υψηλά όσο αυτό του κύριου είδους μελέτης μας, της πράσινης θαλάσσιας χελώνας 17(αναγνώσεις πράσινης θαλάσσιας χελώνας ανά δέκα εκατομμύρια συνολικές αναγνώσεις (RPTM)/ανθρώπινο RPTM ανά μέσο όρο δείγματος άγριου νερού, 1,39· ελάχιστη αναλογία, 1,03· μέγιστη αναλογία, 2,54). 

Όπως ήταν αναμενόμενο, τα δείγματα άμμου αποκατάστασης και νερού δεξαμενής είχαν περισσότερο eDNA θαλάσσιας χελώνας από το ανθρώπινο eDNA (αναλογία RPTM/ανθρώπινο RPTM χελώνας, 63,50 και 18,50, αντίστοιχα). Το υψηλό ποσοστό ανθρώπινου eDNA που ανακτήθηκε από άγρια ​​δείγματα (Εικ. 1β και Συμπληρωματικός Πίνακας 1 ) είναι ιδιαίτερα σημαντικό καθώς οι τοποθεσίες μελέτης μας δεν ήταν άμεσα γειτονικές με περιοχές πυκνής ανθρώπινης κατοίκησης (δηλαδή, πόλεις ή κωμοπόλεις). 

Η σχετική έλλειψη του ανθρώπινου ευθυγραμμιζόμενου eDNA διαβάζεται στον έλεγχο αρνητικού πεδίου νερού και στα δείγματα της δεξαμενής αποκατάστασης (Συμπληρωματικός Πίνακας 1) επιβεβαιώνει ότι η συντριπτική πλειονότητα των αναγνώσεων ευθυγράμμισης του ανθρώπου δεν προήλθε από μόλυνση κατά την επεξεργασία του δείγματος. Συνολικά, 1,8 εκατομμύρια αναγνώσεις ανθρώπινης ευθυγράμμισης ζευγαρωμένου άκρου (300 ζεύγη βάσεων (bp) ανά ζεύγος ανάγνωσης) ανακτήθηκαν ως παρεμπίπτοντα αλιεύματα από αυτήν τη μελέτη eDNA (Εικ. 1β και Συμπληρωματικός Πίνακας 1 ).

Το ανθρώπινο χρωμόσωμα Υ είναι ένα ταχέως εξελισσόμενο ανηγμένο χρωμόσωμα, το οποίο διαφέρει ως προς τη δομή και το περιεχόμενο γονιδίων ακόμη και από τον πλησιέστερο υφιστάμενο συγγενή του ανθρώπου, τον χιμπατζή 25 . 

Τα χρωμοσώματα Υ δεν είναι κοινά μεταξύ όλων των ειδών σπονδυλωτών. είναι ειδικά για τα θηλαστικά. Οι θαλάσσιες χελώνες (το ζώο μελέτης-στόχος μας) δεν διαθέτουν χρωμοσώματα Υ, αντίθετα έχουν προσδιορισμό φύλου που εξαρτάται από τη θερμοκρασία. 

Το ανθρώπινο χρωμόσωμα Υ είναι επομένως μια χρήσιμη περιοχή γονιδιώματος για την επιβεβαίωση της παρουσίας γνήσιων ανθρώπινων αναγνώσεων σε αυτά τα σύνθετα μεταγονιδιωματικά δείγματα αλληλουχίας eDNA. Σε όλα τα δείγματα ανιχνεύθηκαν γονιδιωματικές αναγνώσεις του ανθρώπινου χρωμοσώματος Υ (Εικ. 1β), παρά το μικρό μέγεθος του χρωμοσώματος Υ και τον προεπιλεγμένο αποκλεισμό αναγνώσεων που προέρχονται από ανθρώπινα θηλυκά. 

Τα δείγματα εκβολών ποταμών έτειναν να έχουν υψηλότερες τιμές RPTM του ανθρώπινου χρωμοσώματος Υ από ό,τι τα ωκεάνια δείγματα (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 1β ).

Έχοντας προσδιορίσει ότι η HGB μπορεί να προκύψει από δειγματοληψία eDNA άγριας ζωής, διερευνήσαμε στη συνέχεια τη σκοπιμότητα της σκόπιμης ανάκτησης ανθρώπινου eDNA από θέσεις δειγματοληψίας ύποπτης υψηλής και χαμηλής απελευθέρωσης ανθρώπινου eDNA. Οι ειδικές για το είδος δοκιμές qPCR για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ανθρώπινου eDNA αποκάλυψαν ότι το ανθρώπινο DNA ήταν εύκολα ανακτήσιμο από υδάτινες τοποθεσίες που βρίσκονται κοντά σε πόλεις (Εικ. 1c και 2 και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήματα 1c , 2 και 3 ). 

Αυτά τα ευρήματα επαναλήφθηκαν τόσο στην υποτροπική Φλόριντα όσο και στην εύκρατη Ιρλανδία. Ελάχιστο ανθρώπινο eDNA ανιχνεύθηκε σε έναν ορεινό παραπόταμο (Goldmines River) του ποταμού Avoca, Co. Wicklow, Ιρλανδία, κοντά στην πηγή του και πάνω από τη γραμμή ανθρώπινης κατοίκησης (Εικ. 1γ, 

Εκτεταμένα δεδομένα Σχ. 1γ και Συμπληρωματικός Πίνακας 2 ). 

Αντίθετα, ανθρώπινο eDNA ανιχνεύθηκε μόλις ο ποταμός Avoca εισέλθει στην πόλη Arklow, με τα επίπεδα ανθρώπινου eDNA στον ποταμό να αυξάνονται καθώς ρέει μέσα από την πόλη, πριν αραιωθεί όταν ο ποταμός εισέλθει στη Θάλασσα της Ιρλανδίας (Εικ. 1γ και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ . 1γ και 2α,β ). 

Περισσότερο ανθρώπινο eDNA υπήρχε στα δείγματα εντός της πόλης, παρόλο που λιγότερο από το ήμισυ του όγκου του νερού μπορούσε να φιλτραριστεί σε σύγκριση με τα δείγματα εκτός πόλης, λόγω της αυξημένης απόφραξης του φίλτρου που προκαλείται από πιο θολό νερό (Συμπληρωματικός Πίνακας 2 ) . Ομοίως, κανένα ανθρώπινο eDNA δεν ανιχνεύθηκε από ιδιωτικό πηγάδι, πάνω από τη γραμμή ανθρώπινης κατοίκησης (Εικ. 1γκαι Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 1γ ). 

Μη ανθρώπινο ευκαρυωτικό eDNA ανακτήθηκε από όλα τα ιρλανδικά δείγματα, επιδεικνύοντας επιτυχή εξαγωγή eDNA (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 3 ). 

Παρόμοια με τα ιρλανδικά δείγματα, το ανθρώπινο eDNA ήταν εύκολα ανιχνεύσιμο από δείγματα νερού που λήφθηκαν κοντά στην πόλη St. Augustine της Φλόριντα, ενώ κανένα ανθρώπινο eDNA δεν ήταν ανιχνεύσιμο με qPCR από ωκεάνιο νερό που συλλέχθηκε σε μια εισερχόμενη παλίρροια από τον ωκεανό πέρα ​​από την είσοδο Matanzas, Φλόριντα (Εικ. 2α και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 4 ).

Εικ. 2: Ποσοτικοποίηση ειδικού είδους που βασίζεται σε qPCR του ανθρώπινου eDNA από δειγματοληψία νερού, άμμου και αέρα στη Φλόριντα.
Σχήμα 2

α , Δειγματοληψία νερού eDNA, qPCR, ποσοτικοποιημένη με ZNF285 (αριστερά) και LILRB2 (δεξιά) ειδικές για τον άνθρωπο δοκιμασίες. Ένθετα: οικόπεδο μεγεθυσμένου τμήματος. BI, πέρα ​​από την είσοδο. ML, θαλάσσια γη. MC, Moultrie Creek. 

b , Sand eDNA sampling, qPCR, ποσοτικοποιημένη με ZNF285 (αριστερά) και LILRB2 (δεξιά) ειδικές για τον άνθρωπο δοκιμασίες. 

c , Δειγματοληψία eDNA αέρα δωματίου, qPCR, ποσοτικοποιημένη με ειδικές για τον άνθρωπο δοκιμασίες ZNF285 . 

Εμφανίζεται η απόλυτη ποσότητα (0,1 ng ανά μl ανά αντίδραση) ανθρώπινου eDNA ανά δείγμα. Κάθε αντίδραση qPCR είναι μια αντίδραση 10 μl που περιέχει 1 μl εκχυλισμένου προτύπου eDNA. 

Για τους όγκους φιλτραρισμένου νερού και τους όγκους έκλουσης, δείτε τον Συμπληρωματικό Πίνακα 2. Τα μουστάκια Tukey (εκτείνονται σε σημεία δεδομένων που απέχουν λιγότερο από 1,5 × IQR από το 1ο/3ο τεταρτημόριο) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τετραγωνίδιο. 

Η διάμεσος για κάθε δείγμα εμφανίζεται ως οριζόντια γραμμή μέσα σε κάθε κουτί και οι άκρες του κιβωτίου είναι τα άνω και κάτω τεταρτημόρια. 

Ένα πλαίσιο απεικονίζεται γραφικά ανά μεμονωμένο δείγμα, που αποτελείται από όλα τα τεχνικά αντίγραφα φρεατίων qPCR για αυτό το δείγμα. Τα βιολογικά αντίγραφα δεν συγκεντρώνονται σε κανένα κουτί, με κάθε δείγμα να δηλώνεται με το δικό του κουτί.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Στη συνέχεια, συγκρίναμε την ανάκτηση ανθρώπινου eDNA από ίχνη άμμου παραλίας με αυτήν από ένα νησί με περιορισμένη ανθρώπινη πρόσβαση. Δεν ανιχνεύθηκε ανθρώπινο eDNA με qPCR σε δείγματα άμμου από μια απομακρυσμένη περιοχή του Rattlesnake Island, Φλόριντα, μέρος του Εθνικού Μνημείου Fort Matanzas (Εικ. 2b και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 5 ). Αυτό το μέρος του νησιού είναι απρόσιτο στο ευρύ κοινό. Η πρόσβασή μας διευκολύνθηκε από την Υπηρεσία Εθνικών Πάρκων των ΗΠΑ. Αντίθετα, το ανθρώπινο eDNA ήταν εύκολα ανιχνεύσιμο από δείγματα άμμου παραλίας που ανακτήθηκαν από ανθρώπινα ίχνη (Εικ. 2b ).

Στη συνέχεια, συγκρίναμε την ανάκτηση ανθρώπινου eDNA από τον αέρα σε δωμάτια όπου υπήρχαν άνθρωποι με αυτήν από τον αέρα σε δωμάτια όπου απουσίαζαν άνθρωποι. 

Κανένα ανθρώπινο eDNA δεν ανιχνεύτηκε με qPCR σε μάρτυρες αρνητικού πεδίου (φίλτρα eDNA που έμειναν σε δωμάτια με ανθρώπους παρόντες κατά τη δειγματοληψία, αλλά δεν ήταν συνδεδεμένα με αντλία κενού) ή από αέρα αντλούμενου κενού από δωμάτια στα οποία δεν υπήρχαν άνθρωποι (Εικ. 2γ ) . 

Το ανθρώπινο eDNA ανακτήθηκε από δωμάτια με ανθρώπους παρόντες καθώς οι συμμετέχοντες έκαναν τακτικές δραστηριότητες εργασίας (Εικ. 2γ ). Το ανθρώπινο eDNA ανακτήθηκε παρόλο που συλλέχθηκαν δείγματα αέρα από δωμάτια με ανθρώπους παρόντες από ένα στείρο περιβάλλον κτηνιατρικού νοσοκομείου.

Οι διαφορές στο επίπεδο του ανθρώπινου eDNA που ανιχνεύθηκε ήταν σε γενικές γραμμές σε στενή συμφωνία μεταξύ των δύο ανεξάρτητων ειδικών για είδος αναλύσεων eDNA ( LILRB2 και ZNF285 ). Αυτό υποδεικνύει ότι και τα δύο είναι κατάλληλα για εφαρμογές ανθρώπινου eDNA που βασίζονται σε qPCR (Εικ. 1c και 2a,b και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1c ).

Έχοντας ποσοτικοποιήσει το επίπεδο ανθρώπινου eDNA σε κάθε δείγμα με qPCR, επιλέξαμε επτά δείγματα για την αλληλουχία Oxford Nanopore MinION (Συμπληρωματικός Πίνακας 3 ) για να επιβεβαιώσουμε ότι οι πληροφορίες ανθρώπινου γονιδιώματος θα μπορούσαν να προέρχονται από σκόπιμη δειγματοληψία ανθρώπινου eDNA. 

Η αλληλουχία του MinION κυνηγετικού όπλου διεξήχθη με έξι σκόπιμα δείγματα ανθρώπινου eDNA (που συλλέχθηκαν το 2022) και το δείγμα ελέγχου αρνητικού πεδίου με το μεγαλύτερο ταξίδι στο νερό (που συλλέχτηκε το 2018, ταξίδεψε πάνω από 904 km). 

Η αλληλουχία Nanopore Oxford επιλέχθηκε καθώς δημιουργεί μεγαλύτερα μήκη ανάγνωσης (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 6a,b) από την αλληλουχία Illumina. 

Χωρίς κανένα εμπλουτισμό (αλληλουχία κυνηγετικού όπλου), τα δείγματα ανθρώπινου eDNA στο νερό, άμμου ανθρώπινου αποτυπώματος και αέρα δωματίου επέστρεψαν χιλιάδες αναγνώσεις ευθυγράμμισης του ανθρώπου, ενώ δείγματα νερού ελέγχου αρνητικού πεδίου και δείγματα eDNA άμμου χωρίς ανθρώπινη τοποθεσία (από ίχνος φιδιού) είχε μόνο 2 έως 26 αναγνώσεις ανθρώπινης ευθυγράμμισης (Εικ. 3α και Συμπληρωματικός Πίνακας 3 ). Για όλα τα θετικά για τον άνθρωπο υποστρώματα, οι καλύψεις ήταν σχετικά ομοιόμορφες σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς, με ανιχνεύσεις από όλα τα χρωμοσώματα (Εικ. 3β). 

Η αλληλουχία νανοπόρων αποκάλυψε ότι το eDNA δεν είναι απαραίτητα κατακερματισμένο DNA, καθώς ακόμη και χωρίς τη χρήση μεθοδολογίας εκχύλισης υψηλού μοριακού βάρους ή πρωτοκόλλων προετοιμασίας βιβλιοθήκης μακράς ανάγνωσης (χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα νανοπόρων βραχείας ανάγνωσης), ανακτήσαμε μεμονωμένες αναγνώσεις ανθρώπινου eDNA μήκους έως 148.969 bp (eDNA αέρα, 120,998 bp για το νερό και 39,229 bp για την άμμο) (Εικ. 3b και Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ). 

Η μεγαλύτερη μεμονωμένη ανάγνωση ευθυγράμμισης ανθρώπου-μιτοχονδρίου ήταν 16.535 bp, μόλις 34 bp μικρότερη από το πλήρους μήκους μιτοχονδριακό γονιδίωμα αναφοράς (Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ). Το μέσο μήκος ανάγνωσης σε όλα τα θετικά για τον άνθρωπο δείγματα νανοπόρων ήταν 1.514 bp (Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ).

Εικ. 3: Οξφόρδη Nanopore μακράς ανάγνωσης ακολουθία κυνηγετικών όπλων δειγμάτων eDNA.
σχήμα 3

a , Συνολικός αριθμός αναγνώσεων ανθρώπινης ευθυγράμμισης (Bowtie2) από κάθε δείγμα eDNA πεδίου, δωματίου και αρνητικού πεδίου ελέγχου. 

β , Ο χάρτης ευθυγράμμισης του ανθρώπινου γονιδιώματος της ευθυγράμμισης ανθρώπου διαβάζει (minimap2) από το δείγμα νερού eDNA υψηλής ανθρώπινης τοποθεσίας (Moultrie Creek B), το ανθρώπινο ανδρικό αποτύπωμα 4 δείγμα eDNA και τον αέρα δωματίου 5 ώρες και 30 λεπτά δείγμα eDNA.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Για να αποδείξουμε ότι το ανθρώπινο eDNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για εφαρμογές πέρα ​​από τον απλό ποσοτικό προσδιορισμό, εξετάσαμε γνωστές ανθρώπινες γενετικές παραλλαγές στα δεδομένα του eDNA νανοπόρων για να προσδιορίσουμε εάν οι εφαρμογές που βασίζονται στο eDNA καταγωγής και ευαισθησίας σε ασθένειες μπορεί να είναι εφικτές. Οι διαγραφές που σημειώνονται στο gnomAD (v.2.1) 26 θα μπορούσαν να ανιχνευθούν και στα τρία θετικά για τον άνθρωπο υποστρώματα eDNA του κυνηγετικού όπλου, κυρίως στο νερό αλλά και σε μικρότερο βαθμό σε δείγματα άμμου και αέρα (Εικ. 4α και Συμπληρωματικός Πίνακας 5 ). 

Η μεγαλύτερη διαγραφή που ανιχνεύθηκε σε μία μόνο ανάγνωση ήταν 40.738 bp, ένας κοινός πολυμορφισμός αριθμού αντιγράφων σε ευρωπαϊκούς και λατίνους πληθυσμούς, που εντοπίζεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 2 (Εικ. 4α). 

Τα γονίδια που σχετίζονται με τις διαγραφές (διαγραφές εντός ή δίπλα στο γονίδιο) από το δείγμα νερού Moultrie Creek B έχουν μια σειρά λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης των νευρώνων, της ρύθμισης της επιδιόρθωσης ρήξης διπλού κλώνου και της ρύθμισης της πρωτεόλυσης. 

Διαγραφές σε ή κοντά σε προεξέχοντα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο (για παράδειγμα, ALK , LIN28B , PDGFD και WNT7B ) ανιχνεύθηκαν επίσης (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 7α και Συμπληρωματικός Πίνακας 5 ). Άλλοι τύποι δομικών παραλλαγών (εισαγωγές και αντιγραφές) ήταν επίσης ανιχνεύσιμοι, όταν αναλύθηκαν με τον καλούντα δομικής παραλλαγής που βασίζεται σε EPI2ME Sniffles (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 7β). 

Οι αναγνώσεις ανθρώπινων μιτοχονδρίων από την αλληλουχία νανοπόρου κυνηγετικού όπλου αξιολογήθηκαν επίσης για επιβεβαιωμένα αλληλόμορφα σχετιζόμενα με μιτοχονδριακή παθογένεια (MitoTip 27 και ClinGen 28 ). εντοπίσαμε επτά μιτοχονδριακές μεταλλάξεις (έξι από το eDNA του νερού και μία από το eDNA του αέρα) που σχετίζονται με μια σειρά ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του αυτισμού, του διαβήτη, των οφθαλμικών παθήσεων και των καρδιακών παθήσεων (Συμπληρωματικός Πίνακας 6 ) .

Εικ. 4: Ανάλυση μετάλλαξης και γενετικής καταγωγής δειγμάτων eDNA κυνηγετικών όπλων και εμπλουτισμένων με εξώμα.
σχήμα 4

α , Γνωστές διαγραφές ανθρώπινου γονιδιώματος (βάση δεδομένων gnomAD) που ανιχνεύθηκαν σε δείγμα νερού κυνηγετικού όπλου νανοπόρων, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού και του μεγέθους των διαγραφών (αριστερά) και της γονιδιωματικής θέσης κάθε διαγραφής (δεξιά). Οι θέσεις διαγραφής υποδηλώνονται με μπλε σκίαση. Οι πλήρεις λεπτομέρειες των διαγραφών που εντοπίστηκαν βρίσκονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 5 . 

β , Ποσοστό αναγνώσεων αλληλουχίας από μεταγονιδιωματικά δείγματα eDNA που ευθυγραμμίστηκαν (minimap2) με το ανθρώπινο γονιδίωμα, σε σύγκριση με όλες τις αναγνώσεις που δημιουργήθηκαν για κάθε δείγμα (ανεξαρτήτως είδους προέλευσης). 

Η αλληλουχία του κυνηγετικού όπλου Nanpore συγκρίνεται με τον εμπλουτισμό εξώματος της Illumina. Σημειώστε ότι το ίδιο δείγμα eDNA άμμου ανδρικού αποτυπώματος και το ίδιο δείγμα eDNA υψηλής ανθρώπινης περιεκτικότητας σε νερό χρησιμοποιήθηκε τόσο για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του κυνηγετικού όπλου (νανοπόροι) όσο και για τον εμπλουτισμό του εξώματος (Illumina). ντο, 

Αναγνώσεις απλοομάδας και απλοτύπων ευθυγράμμισης ανθρώπου-μιτοχονδρίου για κάθε σκόπιο ανθρώπινο δείγμα (κυνηγετικό όπλο ή εμπλουτισμένο με εξώμη) και για τα δείγματα αλληλουχίας με κυνηγετικό όπλο Illumina από νερό και άμμο (εστιασμένη σε θαλάσσια χελώνα) με τον υψηλότερο αριθμό ευθυγράμμισης διαβάζει. 

Τα γραφήματα πίτας εντός του ίδιου πλαισίου προέρχονται από δεδομένα αλληλουχίας για τα οποία χρησιμοποιήθηκε το ίδιο αρχικό δείγμα (δηλαδή για τον εμπλουτισμό κυνηγετικού όπλου και εξωμίου). 

δ , Ποσοτικοποίηση των αναγνώσεων ευθυγράμμισης του ιού της πράσινης θαλάσσιας και της θαλάσσιας χελώνας (ChHV5) και του ιού θηλώματος (CmPV1) (minimap2) από τα ίδια δεδομένα αλληλουχίας κυνηγετικών όπλων νανοπόρου eDNA του δωματίου, όπως χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό αναγνώσεων ευθυγράμμισης ανθρώπου (Εικ. 3α ) .

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε τη σκοπιμότητα του εμπλουτισμού του ανθρώπινου εξώματος σε δείγματα eDNA νερού και άμμου. 

Πέντε δείγματα eDNA εμπλουτίστηκαν με ανθρώπινο εξώμα και στη συνέχεια αναλύθηκαν η αλληλουχία τους σε Illumina NovaSeq6000. Τρία από αυτά τα δείγματα είχαν επίσης υποβληθεί σε μακροχρόνια ανάλυση αλληλουχίας (Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ). 

Παρά τον εμπλουτισμό του εξώματος, τα δείγματα ελέγχου αρνητικού πεδίου (NFC sand eDNA Rattlesnake Island site 2 δείγμα 1 και NFC Moultrie Creek) παρήγαγαν πολύ λίγες αναγνώσεις ευθυγράμμισης του ανθρώπου (Εκτεταμένα δεδομένα Σχήμα 7γ και Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ) . 

Και για τα τρία ανθρώπινα θετικά δείγματα eDNA αλληλουχίας, ο εμπλουτισμός εξώματος αύξησε το ποσοστό των αναγνώσεων που ευθυγραμμίζονται με τον άνθρωπο (Εικ. 4β και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 7γ). Μετά τον εμπλουτισμό του εξώματος, το δείγμα eDNA νερού είχε 48% των αναγνώσεων αλληλουχίας που ευθυγραμμίζονται με το ανθρώπινο γονιδίωμα (20,72 δισεκατομμύρια βάσεις ευθυγράμμισης ανθρώπου), που αντιπροσωπεύουν 473× κάλυψη των στοχευόμενων περιοχών ανθρώπινου εξώματος (Εικ. 4β και Συμπληρωματικός Πίνακας 4 ) .

Στη συνέχεια εξετάσαμε την ανάλυση σε επίπεδο ανθρώπινου πληθυσμού σε γονιδιωματικό επίπεδο που υπάρχει στα δείγματά μας eDNA. Οι ίδιες οι ανιχνευθείσες διαγραφές (Εικ. 4a ) συμβαίνουν σε ποικίλες συχνότητες αλληλόμορφων σε διαφορετικούς ανθρώπινους πληθυσμούς (Συμπληρωματικός Πίνακας 5 ). 

Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση απλοομάδων και απλοτύπων σε όλα τα ηθελημένα δείγματα θετικά για το ανθρώπινο eDNA με αλληλουχία: τέσσερα δείγματα νανοπόρου, τρία δείγματα εμπλουτισμένα με εξώμα και την αλληλουχία Illumina με εστίαση στην άγρια ​​ζωή με άμμο και νερό με τον υψηλότερο αριθμό αναγνώσεων ευθυγράμμισης του ανθρώπου. 

Κάθε δείγμα eDNA που αξιολογήθηκε επέτρεπε τη γονιδιωματική ανάλυση πληθυσμού, με τις αναλογίες συγκεκριμένων απλοομάδων και απλοτύπων να ποικίλλουν μεταξύ των δειγμάτων (Εικ. 4γ). Γενικά, οι απλότυποι από την ευρωπαϊκή-ινδική καταγωγή, ιδιαίτερα το H2a2a1, ήταν οι πιο ευρέως ανακτημένοι από κάθε τύπο υποστρώματος (Εικ. 4c ). 

Για δείγματα με γνωστούς συμμετέχοντες (αποτύπωμα και αέρας δωματίου), ο απλότυπος ταίριαζε με το προφίλ των συμμετεχόντων, ενώ για τα δείγματα eDNA νερού, τα αποτελέσματα ταίριαζαν σε γενικές γραμμές με τα δημογραφικά στοιχεία της περιοχής από την οποία ελήφθη το δείγμα ( https://www.census . gov/quickfacts/fact/table/staugustinesouthcdpflorida,staugustinecityflorida/PST045221 ). Ακόμη και χωρίς προηγούμενο εμπλουτισμό, αναγνώσματα που περιέχουν πληροφορίες για τη γενετική καταγωγή και τη γονική προέλευση έχουν ανακτηθεί (Εικ. 4γ και Συμπληρωματικός Πίνακας 5 ).

Κάθε δείγμα περιείχε επίσης ένα σύνθετο μείγμα μικροβιακών αναγνώσεων, που αποδεικνύουν τη χρησιμότητα του eDNA (συμπεριλαμβανομένου του eDNA του αέρα) για την ταυτόχρονη ανίχνευση ανθρώπων, ζώων και μικροβίων (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 8a ,b ). 

Αυτό περιελάμβανε το δείγμα αέρα δωματίου (από ένα νοσοκομείο θαλάσσιας χελώνας), το οποίο είχε αερομεταφερόμενο παθογόνο (ενοχοποιούμενο από όγκο) ιό έρπητα θαλάσσιας χελώνας και DNA ιού θηλώματος καθώς και DNA θαλάσσιας χελώνας (Εικ. 4δ και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ . 8γ και 9α ) .

Συζήτηση

Η ταχεία επέκταση του πεδίου του eDNA σε συνδυασμό με τις ολοένα και πιο αποδοτικές τεχνολογίες βαθιάς αλληλουχίας υπόσχεται μια εκθετική αύξηση στη δημιουργία δεδομένων κυνηγετικών όπλων από περιβαλλοντικά δείγματα τα επόμενα χρόνια 1 , 16 , 19 , 29 , 30 . 

Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ακούσιας μεγάλης κλίμακας HGB από το ευρύ κοινό σε μελέτες eDNA. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η HGB βρέθηκε σε όλα τα δείγματα eDNA πεδίου. Αυτά τα δείγματα είχαν συλλεχθεί κυρίως για την ανίχνευση μη ανθρώπινων ειδών, θαλάσσιων χελωνών, παθογόνων ζώων και μεταγονιδιωματικών 8 , 17. 

Χωρίς ανθρώπινο εμπλουτισμό πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του κυνηγετικού όπλου και με τη δειγματοληψία να έχει διεξαχθεί σε περιοχές με σχετικά χαμηλές πυκνότητες ανθρώπινης κατοίκησης, συλλάβαμε, ωστόσο, κατά λάθος έναν σημαντικό αριθμό δεδομένων ανθρώπινου γονιδιώματος. 

Είναι πιθανό να υπάρχει μια συνέχεια στην οποία το HGB μπορεί να είναι ωφέλιμο, ουδέτερο ή εκμεταλλευτικό - για παράδειγμα, τα δείγματα που συλλέγονται από μια δημοφιλή τουριστική παραλία είναι πιθανό να είναι λιγότερο ηθικά ανησυχητικά από την παρακολούθηση των λυμάτων μικρών, καθορισμένων, σταθερών πληθυσμών. 

Ομοίως, περιοχές με μεγαλύτερο αριθμό ανθρώπινου πληθυσμού είναι πιο πιθανό να επιστρέψουν περισσότερα ανθρώπινα δεδομένα. 

Όταν οι τοποθεσίες δοκιμάστηκαν σκόπιμα, πράγματι ανακτήθηκε πολύ περισσότερο ανθρώπινο eDNA από υδάτινες τοποθεσίες δειγματοληψίας στις οποίες το νερό είχε περάσει από κατοικημένες περιοχές. 

Επί πλέον, Η στοχευμένη αλληλουχία του ανθρώπινου eDNA από σύνθετα μεταγονιδιωματικά δείγματα ήταν άμεσα εφικτή με τις υπάρχουσες προσεγγίσεις εμπλουτισμού εξώματος. Έχοντας αποδείξει την τάση των προσεγγίσεων eDNA να συλλαμβάνουν το ανθρώπινο eDNA εξίσου καλά με αυτό άλλων ειδών, θα εξετάσουμε τώρα τις πιθανές ευεργετικές εφαρμογές και τις ηθικές συνέπειες αυτών των ευρημάτων (Πλαίσιο1 ).

Τουλάχιστον, το HGB μπορεί να περιπλέξει τις εγκρίσεις για έργα αλληλουχίας βαθιάς αλληλουχίας που βασίζονται σε eDNA, απαιτώντας ενδεχομένως την αναθεώρησή τους από επιτροπές ηθικής αναθεώρησης που εστιάζονται στον άνθρωπο, ακόμη και όταν οι άνθρωποι δεν είναι ο επιδιωκόμενος στόχος. 

Καθώς οι προσεγγίσεις του eDNA είναι μη επεμβατικές, απαιτούνται επί του παρόντος περιορισμένες εγκρίσεις, ακόμη και όταν ερευνώνται είδη υπό εξαφάνιση. 

Ως εκ τούτου, τα πρόσθετα επίπεδα ρύθμισης μπορεί να περιπλέξουν την εφαρμογή και την ευρεία υιοθέτηση των προσεγγίσεων eDNA, παρεμποδίζοντας τη διατήρηση και τις εφαρμογές έρευνας για μη ανθρώπινο γονιδίωμα. 

Η σύλληψη μη γενετικών ανθρώπινων πληροφοριών, όπως η ομιλία (οικολογικά ακουστικά δεδομένα) ή οι ανθρώπινες εικόνες (παγίδες κάμερας) έχει θέσει παρόμοια αινίγματα για τους οικολόγους όπως το HGB. 

Σε αυτές τις περιπτώσεις, έχουν προταθεί κώδικες δεοντολογίας, βελτιωμένη εκπαίδευση και αυτοματοποιημένο φιλτράρισμα δεδομένων για την άμβλυνση των ανησυχιών σχετικά με το απόρρητο και τη συναίνεση 31, 32 , 33 , 34 .

Η κατάθεση δεδομένων αλληλουχίας σε δημόσιο αποθετήριο αποτελεί προϋπόθεση για επιστημονικές δημοσιεύσεις και πρωτοβουλίες ανοιχτών δεδομένων. 

Ωστόσο, εάν τα σύνολα δεδομένων αλληλουχίας eDNA περιλαμβάνουν επίσης πληροφορίες ανθρώπινου γονιδιώματος, αυτό μπορεί να προκαλέσει μια πιθανή σύγκρουση. 

Ως εκ τούτου, ένα ανοιχτό ηθικό ερώτημα είναι εάν οποιαδήποτε τέτοια δεδομένα θα πρέπει να φιλτράρονται εκ των προτέρων για να αφαιρεθούν τα δεδομένα ανθρώπινης αλληλουχίας πριν από την εναπόθεση, παρόμοια με την αποαναγνώριση δεδομένων ασθενών 35. 

Αυτό με τη σειρά του εγείρει ζητήματα σχετικά με τη διαφάνεια και τα σωστά κριτήρια φιλτραρίσματος. 

Επιπλέον, σε ποιον πρέπει να ανήκει η ευθύνη της αστυνόμευσης μιας τέτοιας λύσης: περιοδικά, αποθετήρια δεδομένων, επιτροπές δεοντολογίας ή οι ίδιοι οι ερευνητές; 

Μια άλλη εναλλακτική είναι η προσπάθεια ενεργού αποκλεισμού της αλληλουχίας του ανθρώπινου DNA από δείγματα eDNA. 

Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι ακόμη και όταν εφαρμόζονταν ανθρώπινοι αποκλειστές, εξακολουθούσαν να ανιχνεύονται ανθρώπινες αναγνώσεις 36 .

Οι τρέχουσες προσεγγίσεις βαθειάς αλληλουχίας πάσχουν από ένα κάπως παρόμοιο πρόβλημα με το HGB, όπου οι γονιδιωματικές πληροφορίες από το προσωπικό που επεξεργάζεται δείγματα μπορεί να αλληλουχούνται ακούσια 37 , 38. 

Ωστόσο, όσον αφορά τους ηθικούς λόγους, αυτή η ακούσια σύλληψη γονιδιώματος από μόλυνση προκύπτει από έμπειρο προσωπικό που είναι καλά έμπειρο στην τεχνολογία. 

Η ακούσια σύλληψη γονιδιωματικών πληροφοριών από το ευρύ κοινό με βάση το περιβάλλον DNA είναι ένα πιο περίπλοκο ηθικό αίνιγμα, καθώς οι γονιδιωματικές πληροφορίες που συλλέγονται προέρχονται από άτομα που δεν γνωρίζουν κυρίως τη χρήση της τεχνολογίας και αγνοούν το γεγονός ότι οι γενετικές τους πληροφορίες έχουν ληφθεί ακούσια. 

Περιπλέκοντας τα πράγματα, οι ερευνητές ήδη διερευνούν τις δυνατότητες του eDNA για ταυτοποίηση και παρακολούθηση σε ατομικό επίπεδο σε πληθυσμούς άγριας ζωής 39 , 40 , 41. 

Η HGB σε μελέτες μεταγονιδιωματικής του eDNA εγείρει επομένως το ενδιαφέρον ερώτημα εάν μεμονωμένοι άνθρωποι θα μπορούσαν επίσης να ταυτοποιηθούν από δεδομένα eDNA. Αυτό είναι πιθανό, δεδομένης της μη κατακερματισμένης φύσης του eDNA που αναφέρεται εδώ. Αυτό θα μπορούσε να απαιτήσει μελέτες eDNA για την απόκτηση προηγούμενης ενημερωμένης συγκατάθεσης, κάτι που είναι σχεδόν αδύνατο. Δεδομένης της μεγάλης γεωγραφικής περιοχής στην οποία το eDNA μπορεί να ταξιδέψει 1 , 6 , 42 , 43 (ιδιαίτερα για δείγματα νερού 44 , 45 , 46), δεν είναι πρακτικό να φανταστεί κανείς ότι θα μπορούσε ρεαλιστικά να ληφθεί προηγούμενη ενημερωμένη συγκατάθεση. 

Ακόμη και χωρίς στόχευση ή εμπλουτισμό, η αλληλουχία του κυνηγετικού όπλου MinION μπόρεσε να αναγνωρίσει τη γενετική καταγωγή σε συγκεντρωμένους ανθρώπινους πληθυσμούς και να εντοπίσει παραλλαγές που σχετίζονται με την ευαισθησία σε ασθένειες. 

Οι μακρές αναγνώσεις eDNA που ακολουθούνται εδώ υποδηλώνουν ότι με στοχευμένο εμπλουτισμό ενημερωτικών γονιδιωματικών τοποθεσιών, θα μπορούσε κανείς να επιτύχει ταυτοποίηση σε ατομικό επίπεδο ακόμη και από συγκεντρωμένα δείγματα. 

Δεδομένων των προηγμένων προσεγγίσεων στόχευσης που υπάρχουν ήδη για γονιδιωματικές περιοχές ενδιαφέροντος (για παράδειγμα, από έρευνα γονιδιωματικής ασθένειας και πληθυσμού, προσαρμοστική αλληλουχία νανοπόρου 47 , 48 , 49 , 50 , 51ή τον εμπλουτισμό εξώματος που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη), η στόχευση συγκεκριμένων περιοχών ή παραλλαγών από δείγματα ανθρώπινου eDNA είναι ήδη απολύτως εφικτή.

Ενώ τα δεδομένα μας καταδεικνύουν τη δυνατότητα παρεμπιπτόντων αλιευμάτων ανθρώπινου γονιδιώματος σε μελέτες eDNA με γνώμονα την άγρια ​​ζωή, υπογραμμίζουν επίσης τη σκοπιμότητα στοχευμένων εφαρμογών ανθρώπινου eDNA. 

Ιδιαίτερα ευαίσθητες ή ενημερωτικές περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος θα μπορούσαν να στοχοποιηθούν σκόπιμα. Τα ζητήματα προστασίας της ιδιωτικής ζωής του ανθρώπου σχετίζονται ιδιαίτερα με την αυξημένη χρήση ανίχνευσης παθογόνων από ανθρώπινα λύματα κατά τη διάρκεια της πανδημίας COVID-19 1 , 11 , 12 . 

Ακόμη και σε σχέση με παθογόνους παράγοντες, οι νομικές και ηθικές συνέπειες της παρακολούθησης των λυμάτων δεν έχουν ληφθεί επαρκώς υπόψη. 

Τα λύματα χρησιμοποιούνται επί του παρόντος για την ανίχνευση παράνομων ναρκωτικών, αντικαταθλιπτικών, δεικτών στρες και κατανάλωσης αλκοόλ 52. 

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι τέτοια ηθικά διλήμματα πρέπει να ληφθούν υπόψη όχι μόνο για τη δειγματοληψία λυμάτων αλλά για το πεδίο του eDNA συνολικά, με το HGB να είναι εφικτό από περιβαλλοντική δειγματοληψία αέρα, νερού και υποστρώματος.

Δεδομένης της αποδεδειγμένης σκοπιμότητας της ανάλυσης ανθρώπινου eDNA, συμπεριλαμβανομένης της κλήσης θέσεων που σχετίζονται με ασθένεια, είναι πιθανό να υπάρχουν ευεργετικές εφαρμογές για τέτοιες προσεγγίσεις eDNA προσανατολισμένες στον άνθρωπο (Πλαίσιο 2 ). 

Για παράδειγμα, θα μπορούσε κανείς να χρησιμοποιήσει δειγματοληψία με βάση το eDNA λυμάτων ή αέρα για να συσχετίσει το επίπεδο των παθογόνων με την αφθονία των τόπων ευαισθησίας σε έναν δεδομένο πληθυσμό 1 , 13 , 15 , 53 , 54 . 

Αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα εφικτό δεδομένης της διαρκώς αυξανόμενης φορητότητας της τεχνολογίας προσδιορισμού αλληλουχίας DNA/επιτήρησης 1 , 29. 

Είναι επίσης άμεσα εφικτό να εξεταστεί η σκόπιμη δειγματοληψία eDNA ανθρώπου και παθογόνου από συγκεκριμένες πηγές, όπως αποτυπώματα υποστρώματος ή eDNA φιλτραρισμένου αέρα (όπως αναφέρουμε εδώ) από συγκεκριμένες τοποθεσίες - για παράδειγμα, δωμάτια στο σπίτι, δημόσιους εσωτερικούς ή εξωτερικούς χώρους, νοσοκομειακοί θάλαμοι, ή ακόμη και ειδικοί διαγνωστικοί χώροι σχεδιασμένοι να φιλτράρουν το eDNA του ξενιστή και του παθογόνου που αποβάλλεται από έναν μόνο ασθενή σε σύντομο χρονικό διάστημα. 

Εδώ αναφέρουμε ότι η δειγματοληψία αέρα δωματίου σε κλινικό περιβάλλον (κτηνιατρικό νοσοκομείο) ανέκτησε ιικά παθογόνα ξενιστή (ζώο ασθενή), άνθρωπο (προσωπικό) και σπονδυλωτά, προτείνοντας μελλοντικές νέες προσεγγίσεις παρακολούθησης σε ιατρικά περιβάλλοντα ανθρώπων και ζώων και όχι μόνο. 

Εναλλακτικά, το eDNA του νερού που συλλέγεται πριν φύγουν τα λύματα από το σπίτι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί, που συνδέεται με τη συνεχή παρακολούθηση της υγείας και τις πρωτοβουλίες διαχείρισης χρόνιων ασθενειών55 . 

Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη συνεχή παρακολούθηση της υγείας ρουτίνας για σωματικές μεταλλάξεις, οι οποίες εμφανίζονται αργότερα στη ζωή και μπορεί να είναι οδηγοί απειλητικών για τη ζωή ασθενειών όπως ο καρκίνος. 

Οι προσεγγίσεις του ανθρώπινου eDNA μπορούν να συνδυαστούν με τις προόδους της συνεχιζόμενης γονιδιωματικής ιατρικής επανάστασης 24 για να επιτρέψουν νέες εφαρμογές, όπως αποδεικνύεται εδώ από την ικανότητα ανίχνευσης συγκεκριμένων μεταλλάξεων που σχετίζονται με ανθρώπινες ασθένειες από το eDNA και εμπλουτισμού για τις ανθρώπινες γονιδιωματικές περιοχές ενδιαφέροντος (για παράδειγμα, exome ) και ταυτόχρονη ανίχνευση μικροβίων, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων ιών.

Ο απλότυπος και η φυλογενετική ανάλυση ατόμων (φαλαινοκαρχαρίες, θαλάσσιες χελώνες και κακάπο) από δείγματα eDNA έχουν ήδη επιτευχθεί, αν και μέχρι σήμερα αυτά τείνουν να είναι δείγματα στα οποία κυριαρχεί ένα μεμονωμένο άτομο 17 , 47 , 51 , 56 . 

Η μελέτη μας προσθέτει ανθρώπους σε αυτήν τη λίστα και υπογραμμίζει τον τρόπο με τον οποίο μπορεί να επιτευχθεί ο απλότυπος από πολύπλοκα πολλαπλά μεμονωμένα (μεταγονιδιωματικά) δείγματα με διαφορετικές δομές πληθυσμού. 

Δεδομένης της λιγότερο προκατειλημμένης φύσης του, το ανθρώπινο eDNA μπορεί επίσης να βοηθήσει στην αποκατάσταση της ισορροπίας σε σχέση με την έλλειψη αλληλουχίας γονιδιωμάτων από διαφορετικούς πληθυσμούς και υποεκπροσωπούμενων σπάνιων ανθρώπινων αλληλόμορφων σε γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων. Παραδοσιακά, αυτές οι βάσεις δεδομένων στρέφονται προς πληθυσμούς ευρωπαϊκής καταγωγής 57 .

Ξεχωριστά, η γενετική ανάλυση εφαρμόζεται ήδη για την καταπολέμηση του παράνομου εμπορίου άγριας ζωής με τον εντοπισμό των πληθυσμών ζώων προέλευσης 58 , 59. 

Ομοίως, μπορεί να είναι δυνατή η υιοθέτηση τέτοιων προσεγγίσεων για τη στόχευση του ανθρώπινου eDNA που ανακτάται από παράνομα μέρη άγριας ζωής (χειρισμός λαθροκυνηγών/εμπόρων) για τον ευρέως προσδιορισμό των γεωγραφικών ανθρώπινων πληθυσμών μέσω των οποίων διήλθαν τα παράνομα μέρη. 

Το ανθρώπινο eDNA θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό τοποθεσιών αρχαιολογικής σημασίας. Τέτοιες δυνατότητες περιλαμβάνουν δειγματοληψία απομακρυσμένων στάσιμων υδάτινων σωμάτων (για παράδειγμα, τυρφώνων) για τον εντοπισμό άγνωστων θέσεων θυσιών ή δειγματοληψία eDNA για να βοηθήσει στην ανάκτηση πιο πρόσφατων ανθρώπινων λειψάνων. Ακόμη και οι αποστολές έρευνας και διάσωσης θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν τεχνικές eDNA, εάν η δειγματοληψία eDNA από drones είναι επιτυχής επί του παρόντος. 

Πρόσφατα, υποστηρίχθηκε ότι το ανθρώπινο eDNA που εξάγεται από τον αέρα θα μπορούσε επίσης να έχει νέες εφαρμογές ιατροδικαστικής και ποινικής έρευνας 60 , 61, 62 . 

Η γονιδιωματική αξιολόγηση του ανθρώπινου πληθυσμού του αερομεταφερόμενου DNA είναι ένα πρώιμο βήμα προς αυτή την κατεύθυνση, παρέχοντας την απόδειξη της ιδέας της ανάκτησης ανθρώπινου DNA ποιότητας κυνηγετικής αλληλουχίας από τον αέρα του δωματίου. 

Τόσο το αρχαίο όσο και το σύγχρονο DNA έχουν τις δικές τους καθιερωμένες ηθικές διαδικασίες, αν και και σε αυτούς τους κλάδους, ο ρυθμός προόδου έχει ξεπεράσει τον διάλογο για την ηθική της έρευνας 63 , 64 , 65 , 66 . 

Το eDNA του αέρα των σπονδυλωτών είναι ένα πρόσφατο πεδίο μελέτης και οι βελτιωμένες συσκευές σύλληψης είναι ένας ενεργός τομέας έρευνας από τον οποίο θα μπορούσαν να ωφεληθούν οι εφαρμογές του ανθρώπινου αερομεταφερόμενου DNA 36 . 

Οι προσεγγίσεις eDNA που βασίζονται στο νερό έχουν επίσης θεωρηθεί ότι είναι ωφέλιμες για ιατροδικαστικές έρευνες 67 ,68 . 

Η εγκληματολογική επιστήμη έχει καθιερωμένες διαδικασίες δεοντολογίας, αν και εξακολουθούν να υφίστανται ζητήματα που σχετίζονται με τις φυλετικές διακρίσεις 69 , 70 . 

Συνολικά, μπορούν να προβλεφθούν ιατροδικαστικές εφαρμογές για προσεγγίσεις eDNA του αέρα, του εδάφους και του νερού, ειδικά υπό το φως της άθικτης μη κατακερματισμένης φύσης του eDNA που αναφέρεται εδώ.

Ενώ μπορεί να υπάρχουν οφέλη από την ανθρώπινη ανάλυση eDNA, θα μπορούσαν να υπάρξουν πιο ανησυχητικές εφαρμογές αυτής της τεχνολογίας. 

Η συσσώρευση γονιδιωματικών βάσεων δεδομένων σε επίπεδο πληθυσμού είναι επί του παρόντος ιδιαίτερα επιθυμητή, καθώς είναι ένα πολύτιμο ερευνητικό και εμπορικό προϊόν 71 , 72 . 

Ενώ ορισμένα έργα διατηρούν τα γονιδιωματικά δεδομένα και τα επακόλουθα ευρήματα σε δημόσια ιδιοκτησία, το κερδοφόρο οικονομικό δυναμικό τέτοιων βάσεων δεδομένων σημαίνει ότι μια σειρά από ιδιωτικές εταιρείες τα συγκεντρώνουν επίσης γρήγορα (για παράδειγμα, εταιρείες καταγωγής DNA και εταιρείες γονιδιωματικής ιατρικής) και πωλούν πρόσβαση 72 , 73. 

Χώρες και εταιρικές οντότητες αγωνίζονται για να δημιουργήσουν ολοένα μεγαλύτερα πανγονιδιωματικά σύνολα δεδομένων ασθενών/πληθυσμού. 

Παραδείγματα περιλαμβάνουν το έργο 100.000 Genomes και τη νέα Στρατηγική Genome UK ( https://www.gov.uk/government/publications/genome-uk-the-future-of-healthcare ); το έργο Biobank, το οποίο στοχεύει στην αλληλουχία μισού εκατομμυρίου γονιδιωμάτων ( https://www.sanger.ac.uk/collaboration/uk-biobank-whole-genome-sequencing-project/ ); και το Ερευνητικό Πρόγραμμα Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας All of Us ( https://allofus.nih.gov/), ένα έργο για την αλληλουχία των γονιδιωμάτων ενός εκατομμυρίου πολιτών των ΗΠΑ. 

Τέτοιες πανγονιδιωματικές δραστηριότητες έχουν τη δυνατότητα για μεγάλο δημόσιο καλό, συμπεριλαμβανομένων προηγμένων ιατρικών και φαρμακευτικών εφαρμογών, αλλά αποτέλεσαν ένα ηθικό ναρκοπέδιο όσον αφορά την ιδιοκτησία, την προστασία δεδομένων, την ασφαλιστική κάλυψη και τα ζητήματα απορρήτου 24 , 72 , 74 , 75 , 76 . 

Παραδείγματα από ψηφιακές βάσεις δεδομένων δείχνουν επίσης ξεκάθαρα ότι οπουδήποτε υπάρχουν πολύτιμες βάσεις δεδομένων, υπάρχει ένας διαρκώς παρών πειρασμός για εκμετάλλευση των δεδομένων για οικονομικό όφελος, είτε νομικά είτε με άλλο τρόπο. 

Το σκάνδαλο Cambridge Analytica, το οποίο αφορούσε πολύπλοκη συλλογή δεδομένων από προφίλ στο Facebook 77, είναι ένα τέτοιο παράδειγμα, και η συλλογή ιατρικών αρχείων από την Google με ατομικές πληροφορίες ταυτοποίησης ακόμα ανέπαφα είναι ένα άλλο 78 .

Οι εφαρμογές ανθρώπινου eDNA παρουσιάζουν παρόμοιες ανησυχίες: θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση ατόμων, μειονοτικών ομάδων (γενετική καταγωγή) ή γενετικά προκαλούμενων αναπηριών ή για τη λήψη γονιδιωματικών πληροφοριών από τοπικούς πληθυσμούς χωρίς τη γνώση ή τη συγκατάθεσή τους, συμπεριλαμβανομένων των «πολύτιμων» γενετικά διαφορετικών ιθαγενών πληθυσμούς (φυλές χωρίς επαφή, συγκεκριμένες εθνοτικές ομάδες και ούτω καθεξής). 

Τέτοια σενάρια διευρύνουν τα τρέχοντα ζητήματα σχετικά με την εμπορευματοποίηση της γονιδιωματικής πληροφορίας, η οποία είναι ήδη μια ιδιαίτερα έντονη ανησυχία σε σχέση με τους αυτόχθονες πληθυσμούς 72 , 79 , 80 , 81. Αυτές οι νέες εφαρμογές ανθρώπινου eDNA μπορούν επίσης να επιτρέψουν σε αδίστακτες (αν και πιθανώς όχι τεχνικά παράνομες) οντότητες να πραγματοποιήσουν μυστική μαζική σύλληψη γονιδιωματικών δεδομένων από πληθυσμούς, για να επεκτείνουν περαιτέρω τις βάσεις δεδομένων γονιδιώματος σε επίπεδο πληθυσμού. Επιπλέον, τέτοιοι πόροι μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για βελτιωμένη παρακολούθηση ατόμων για λιγότερο ευχάριστους σκοπούς. 

Η γενετική/γονιδιωματική επιτήρηση αποτελεί σοβαρό ηθικό πρόβλημα, καθώς έχουν ήδη σημειωθεί τεκμηριωμένες παραβιάσεις των ανθρωπίνων δικαιωμάτων, όπου οι εθνικές βάσεις δεδομένων DNA χρησιμοποιήθηκαν μαζί με άλλα δεδομένα επιτήρησης για την παρακολούθηση μειονοτικών πληθυσμών 70 , 82. 

Η εφαρμογή προσεγγίσεων ανθρώπινου eDNA θα μπορούσε να υπονομεύσει περαιτέρω τη γενετική συναίνεση, περιορίζοντας την ικανότητα των απειλούμενων μειονοτήτων να αποκρύπτουν τις γενετικές τους πληροφορίες. Στο μέλλον, το ανθρώπινο eDNA θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί εάν μέλη μιας γενετικά διακριτής ομάδας υπήρχαν σε έναν δεδομένο πληθυσμό - για παράδειγμα, μέσω παρακολούθησης λυμάτων ή φιλτραρίσματος αέρα σε σημεία ελέγχου, σε αστικές περιοχές ή σε ιδιωτικές κατοικίες. Αυτή η δυνατότητα είναι ιδιαίτερα ανατριχιαστική, δεδομένης της τάσης των ανθρώπων να πραγματοποιούν εθνοτικές διώξεις και γενοκτονίες σε όλη την ιστορία μας.

Πολλά από τα ηθικά ζητήματα που τίθενται εδώ είναι πιο πιθανό να προκύψουν όταν οι τοποθεσίες δειγματοληψίας είναι πιο κοντά σε ανθρώπινες αστικές περιοχές. 

Ομοίως, ζητήματα που σχετίζονται με άτομα ή εθνοτικές ομάδες είναι πιο πιθανό να αφορούν περιοχές με μικρούς, σταθερούς πληθυσμούς ανθρώπων που συμβάλλουν στο ανακτημένο eDNA—για παράδειγμα, μια συγκεκριμένη λεκάνη απορροής ή τμήμα ενός συστήματος αποχέτευσης. 

Είναι σαφές ότι βραχυπρόθεσμα η σύγκλιση μαζικά ισχυρών τεχνολογιών βαθειάς αλληλουχίας με βελτιώσεις στις οικολογικές προσεγγίσεις σύλληψης δειγμάτων eDNA εγείρει σοβαρά ερωτήματα σχετικά με τα ανθρώπινα γονιδιωματικά παρεμπίπτοντα αλιεύματα, που απαιτούν συζήτηση και ρυθμιστική εξέταση από επιστημονικές, ηθικές, ρυθμιστικές και κοινωνικές προοπτικές. 

Οι ρυθμιστικές αρχές, οι ερευνητές, οι χρηματοδότες και άλλα ενδιαφερόμενα μέρη θα πρέπει να αναπτύξουν απαντήσεις στις ηθικές επιπτώσεις των εφαρμογών HGB και σκόπιμων ανθρώπινων eDNA. 

Αυτός ο σχεδιασμός θα πρέπει να ξεκινήσει αμέσως, προλαμβάνοντας η τεχνολογία να γίνει ακόμη πιο διαδεδομένη, προσιτή και εδραιωμένη, είτε πρόκειται για ωφέλιμες είτε για εκμεταλλευτικές εφαρμογές. 

Αυτός ο εκ των προτέρων σχεδιασμός είναι ζωτικής σημασίας για τη διασφάλιση ότι οι νόμοι και η ηθική βρίσκονται μπροστά από την αναδυόμενη τεχνολογία. Αντίθετα, αυτές οι ίδιες προσεγγίσεις eDNA μπορούν να ανοίξουν νέες ευεργετικές εφαρμογές σε τομείς από την ανθρώπινη υγεία έως την εγκληματολογία.

Μέθοδοι

Συλλογή δειγμάτων, εξαγωγή DNA και αλληλούχιση

Όλες οι εργαστηριακές διαδικασίες από τη δειγματοληψία έως την τελική ανάλυση (αλληλουχία ή qPCR) διεξήχθησαν με τρόπο που ελαχιστοποιούσε τυχόν μόλυνση ανθρώπινου DNA από τους ερευνητές. 

Αν και τα δείγματα του Illumina HiSeq eDNA είχαν επίσης δειγματιστεί και χρησιμοποιηθεί για έρευνα σε θαλάσσιες χελώνες και παθογόνα, ο αρχικός σχεδιασμός της μελέτης για αυτά τα δείγματα περιελάμβανε αξιολόγηση των αναγνώσεων ευθυγράμμισης του ανθρώπου από αυτά τα δεδομένα κυνηγετικών όπλων. 

Ως εκ τούτου, ελήφθησαν όλες οι κατάλληλες προφυλάξεις για την αποφυγή μόλυνσης. Αυτό περιελάμβανε την απουσία επαφής ερευνητών ή δειγματοληπτών με τα υποστρώματα δειγματοληψίας (νερό ή άμμο), χρήση νέων γαντιών νιτριλίου για κάθε συλλογή δείγματος, συχνές αλλαγές γαντιών κατά την επεξεργασία του δείγματος, καθαρισμός εξοπλισμού και πάγκων με λευκαντικό πριν από τη χρήση. και μάρτυρες αρνητικού πεδίου που αντιμετωπίζονται πανομοιότυπα με τα γνήσια δείγματα πεδίου σε όλες τις διεργασίες από την εκχύλιση έως την qPCR/αλληλουχία (βλ. παρακάτω). 

Όλα τα δείγματα eDNA εξήχθησαν σε εργαστήρια που δεν επεξεργάζονται ανθρώπινα δείγματα: ένα εργαστήριο θαλάσσιας χελώνας στη Φλόριντα και ένα εργαστήριο αναπτυξιακής βιολογίας νεοσσών/ποντικών στην Ιρλανδία. 

Τα ιρλανδικά qPCR τοποθετήθηκαν σε θάλαμο στρωτής ροής μετά από παρατεταμένη έκθεση 1 ώρας στην υπεριώδη ακτινοβολία του θαλάμου και του εξοπλισμού. 

Αρχικά υποτέθηκε ότι το δείγμα νερού της δεξαμενής αποκατάστασης θαλάσσιας χελώνας (2017, HiSeq) θα περιέχει περισσότερο ανθρώπινο DNA από τα δείγματα νερού πεδίου, λόγω των αλληλεπιδράσεων του προσωπικού των νοσοκομείων με το νερό της δεξαμενής και ασθενείς με θαλάσσια χελώνα. 

Για όλες τις επόμενες δειγματοληψίες eDNA, είχαμε ήδη διαπιστώσει ότι το δείγμα δεξαμενής του 2017 περιείχε λιγότερο ανθρώπινο eDNA από τα δείγματα πεδίου του 2017. 

Επομένως, συνεχίσαμε να τηρούμε αυστηρές διαδικασίες για την αποφυγή μόλυνσης από τον ερευνητή σε όλες τις επόμενες δειγματοληψίες, προκειμένου να μπορέσουμε να διερευνήσουμε την HGB. 

Ενώ σκοπεύαμε εκ των προτέρων να αξιολογήσουμε το επίπεδο του ανθρώπινου eDNA που ανακτήθηκε από τα δείγματα του 2017 και του 2020, δεν λήφθηκαν υπόψη ανθρώπινοι παράγοντες (όπως η πυκνότητα πληθυσμού) κατά την επιλογή των τόπων δειγματοληψίας. 

Η επιλογή τοποθεσίας βασίστηκε καθαρά στις εκτιμήσεις του eDNA της άγριας ζωής αυτών των τοποθεσιών—δηλαδή, η επιλογή τοποθεσίας δεν ήταν προκατειλημμένη προς περιοχές με υψηλή ανθρώπινη πυκνότητα. Αντίθετα, η επιλογή τοποθεσίας για όλα τα δείγματα του 2022 κατευθύνθηκε σκόπιμα σε τοποθεσίες με υψηλές ή χαμηλές ανθρώπινες διαταραχές (κυρίως με βάση την πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού). 

Ενώ σκοπεύαμε εκ των προτέρων να αξιολογήσουμε το επίπεδο του ανθρώπινου eDNA που ανακτήθηκε από τα δείγματα του 2017 και του 2020, δεν λήφθηκαν υπόψη ανθρώπινοι παράγοντες (όπως η πυκνότητα πληθυσμού) κατά την επιλογή των τόπων δειγματοληψίας. 

Η επιλογή τοποθεσίας βασίστηκε καθαρά στις εκτιμήσεις του eDNA της άγριας ζωής αυτών των τοποθεσιών—δηλαδή, η επιλογή τοποθεσίας δεν ήταν προκατειλημμένη προς περιοχές με υψηλή ανθρώπινη πυκνότητα. Αντίθετα, η επιλογή τοποθεσίας για όλα τα δείγματα του 2022 κατευθύνθηκε σκόπιμα σε τοποθεσίες με υψηλές ή χαμηλές ανθρώπινες διαταραχές (κυρίως με βάση την πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού). 

Ενώ σκοπεύαμε εκ των προτέρων να αξιολογήσουμε το επίπεδο του ανθρώπινου eDNA που ανακτήθηκε από τα δείγματα του 2017 και του 2020, δεν λήφθηκαν υπόψη ανθρώπινοι παράγοντες (όπως η πυκνότητα πληθυσμού) κατά την επιλογή των τόπων δειγματοληψίας. 

Η επιλογή τοποθεσίας βασίστηκε καθαρά στις εκτιμήσεις του eDNA της άγριας ζωής αυτών των τοποθεσιών—δηλαδή, η επιλογή τοποθεσίας δεν ήταν προκατειλημμένη προς περιοχές με υψηλή ανθρώπινη πυκνότητα. 

Αντίθετα, η επιλογή τοποθεσίας για όλα τα δείγματα του 2022 κατευθύνθηκε σκόπιμα σε τοποθεσίες με υψηλές ή χαμηλές ανθρώπινες διαταραχές (κυρίως με βάση την πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού).

Το προηγουμένως εκχυλισθέν DNA 8 πράσινων θαλάσσιων χελωνών και καρέτα καρέτα από δείγματα ιστών χρησιμοποιήθηκε για δοκιμές qPCR ειδικότητας ειδών. 

Το DNA εξήχθη από ιστό χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, αρ. κατ. 69504) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 

Τα κύτταρα SH-SY5Y (ATCC, αρ. κατ. CRL-2266) δόθηκαν από το εργαστήριο Loesgen (Πανεπιστήμιο της Φλόριντα) και δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ανθρώπινα κύτταρα στο ίδιο εργαστήριο με τα δείγματα eDNA. Το DNA εξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen DNeasy Blood and Tissue σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 

Το γονιδιωματικό DNA του SH-SY5Y χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία τυπικών καμπυλών. Για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή μόλυνση, οι τυπικές καμπύλες εκτελέστηκαν μόνο αφού είχαν ολοκληρωθεί όλα τα eDNA qPCR.

Δείγματα HGB

Δείγματα eDNA θαλασσινού νερού (δεξαμενή αποκατάστασης και ωκεάνιου) και άμμου παραλίας συλλέχθηκαν μεταξύ 2017 και 2021 και αναλύθηκαν ως μέρος της έρευνάς μας για παθογόνα θαλάσσιας και θαλάσσιας χελώνας 8 , 17 . 

Όλα τα δείγματα προέρχονται από τη Φλόριντα, ΗΠΑ 8 , 17 . Το δείγμα της δεξαμενής είναι ένα ομαδοποιημένο 8 , 17δείγμα που περιέχει eDNA που εξήχθη από θαλασσινό νερό από πέντε δεξαμενές αποκατάστασης στο Whitney Laboratory for Marine Bioscience and Sea Turtle Hospital του Πανεπιστημίου της Φλόριντα. 

Οι τέσσερις κύριες δεξαμενές φιλοξενούσαν νεαρές πράσινες θαλάσσιες χελώνες και είχαν διάμετρο 240 cm και πλήρη όγκο 2.270 λίτρων και μια μικρότερη δεξαμενή μετά την εκκόλαψη είχε όγκο 480,75 λίτρων. Το ξεχωριστά εξαγόμενο eDNA από κάθε δεξαμενή συγκεντρώθηκε σε ίσους όγκους πριν από την προετοιμασία της βιβλιοθήκης.

Σκόπιμα ανθρώπινα δείγματα

Δείγματα ποταμών, εκβολών ποταμών, θαλασσινού νερού (ωκεάνιας) και άμμου παραλίας συλλέχθηκαν μεταξύ Μαΐου και Ιουλίου 2022 (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). 

Συλλέχθηκαν επίσης αρνητικά δείγματα ελέγχου πεδίου νερού και άμμου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τα δείγματα της μελέτης. 

Για δειγματοληψία νερού αρνητικού πεδίου ελέγχου, 1 λίτρο νερού MilliQ (Φλόριντα) ή 1 λίτρο νερού Qiagen χωρίς νουκλεάση (Ιρλανδία, αρ. κατ. 129117) μεταφέρθηκε από το εργαστήριο στις περιοχές αποκατάστασης ή άγριας δειγματοληψίας και αποθηκεύτηκε σε δροσερό κουτί με τα περιβαλλοντικά δείγματα για παρακολούθηση για πιθανή μόλυνση κατά τη δειγματοληψία, τη μεταφορά και την επεξεργασία. 

Για δειγματοληψία άμμου αρνητικού πεδίου ελέγχου θαλάσσιας χελώνας, συλλέγονταν 50 ml άμμου παραλίας μακριά από ύποπτη παρουσία χελώνας (δηλαδή μακριά από ίχνη θαλάσσιας χελώνας ή εμφανή ανθρώπινη δραστηριότητα) σε κάθε ταξίδι δειγματοληψίας. 

Για δειγματοληψία άμμου ελέγχου αρνητικού πεδίου ανθρώπου, 50 ml άμμου παραλίας συλλέχθηκαν μακριά από ύποπτη ανθρώπινη δραστηριότητα (όπως αποτυπώματα) σε κάθε ταξίδι δειγματοληψίας και από τοποθεσία περιορισμένης πρόσβασης στο νησί Rattlesnake, μέρος του Εθνικού Μνημείου Fort Matanzas που διαχειρίζεται η Υπηρεσία Εθνικών Πάρκων των ΗΠΑ. 

Οι μάρτυρες αρνητικού πεδίου νερού και άμμου διηθήθηκαν και εκχυλίστηκαν μαζί με τα άλλα δείγματα άμμου και νερού που συλλέχθηκαν από κάθε ταξίδι δειγματοληψίας και υποβλήθηκαν στις ίδιες συνθήκες αλληλουχίας επόμενης γενιάς και συνθήκες qPCR (σκόπιμα ανθρώπινα δείγματα). 

Ο τυπικός όγκος φιλτραρισμένου θαλασσινού νερού (Μονάδες φίλτρου πίεσης Millipore Sterivex-GP με πόρους 0,22 μm (Merk Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC)) ήταν 500 ml για κάθε δείγμα DNA 

Οι μάρτυρες αρνητικού πεδίου νερού και άμμου διηθήθηκαν και εκχυλίστηκαν μαζί με τα άλλα δείγματα άμμου και νερού που συλλέχθηκαν από κάθε ταξίδι δειγματοληψίας και υποβλήθηκαν στις ίδιες συνθήκες αλληλουχίας επόμενης γενιάς και συνθήκες qPCR (σκόπιμα ανθρώπινα δείγματα). 

Ο τυπικός όγκος φιλτραρισμένου θαλασσινού νερού (Μονάδες φίλτρου πίεσης Millipore Sterivex-GP με πόρους 0,22 μm (Merk Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC)) ήταν 500 ml για κάθε δείγμα DNA 

Οι μάρτυρες αρνητικού πεδίου νερού και άμμου διηθήθηκαν και εκχυλίστηκαν μαζί με τα άλλα δείγματα άμμου και νερού που συλλέχθηκαν από κάθε ταξίδι δειγματοληψίας και υποβλήθηκαν στις ίδιες συνθήκες αλληλουχίας επόμενης γενιάς και συνθήκες qPCR (σκόπιμα ανθρώπινα δείγματα). 

Ο τυπικός όγκος φιλτραρισμένου θαλασσινού νερού (Μονάδες φίλτρου πίεσης Millipore Sterivex-GP με πόρους 0,22 μm (Merk Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC)) ήταν 500 ml για κάθε δείγμα DNA8 , 17 . Δείγματα μικρότερα από 500 ml (Συμπληρωματικοί πίνακες 1 και 3 ) ήταν μικρότερος όγκος λόγω των συντριμμιών που έφραζαν το φίλτρο και εμποδίζονταν το φιλτράρισμα μεγαλύτερων όγκων. 

Ένα δείγμα («παλιρροϊκή πισίνα») είχε φιλτραριστεί 1 λίτρο θαλασσινού νερού. 

Για το eDNA άμμου, ένας σωλήνας 50 ml γεμίστηκε με άμμο από κάθε συμβάν δειγματοληψίας, με 10 ml αυτής της άμμου να χρησιμοποιούνται ανά μεμονωμένη εκχύλιση eDNA 17 . 

Δείγματα αέρα από τον άνθρωπο συλλέχθηκαν από 280 πόδια 2δωμάτιο ενώ οι συμμετέχοντες έκαναν τις καθημερινές τους εργασιακές δραστηριότητες (δηλαδή μπορούσαν να εισέλθουν και να βγουν από την αίθουσα καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου δειγματοληψίας), με μέγιστο από τους ίδιους έξι συμμετέχοντες να χρησιμοποιούν την αίθουσα για ένα μέρος της περιόδου δειγματοληψίας. 

Το δωμάτιο ήταν κλιματιζόμενο (εξωτερικός αέρας) και είχε μια εξωτερική πόρτα που άνοιγε και έκλεινε, και περιστασιακά άφηνε ανοιχτή για ορισμένες διαδικασίες εργασίας. Συλλέχθηκαν επίσης αρνητικά δείγματα αέρα ελέγχου πεδίου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τα δείγματα της μελέτης. 

Για το eDNA του αέρα, συλλέχθηκαν δύο τύποι μαρτύρων αρνητικού πεδίου: (1) ένα φίλτρο που διατηρείται στο δωμάτιο που λαμβάνεται δειγματοληψία κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας, αλλά χωρίς αέρα να διέρχεται από αυτό (δηλαδή, χωρίς αντλία) και (2) φιλτραρισμένος αέρας (με αντλία) από δωμάτιο όπου δεν υπάρχουν άνθρωποι κατά τη στιγμή του φιλτραρίσματος ή κατά τις προηγούμενες 24 ώρες. 

Η δειγματοληψία που σχετίζεται με τον άνθρωπο διεξήχθη με δεοντολογική έγκριση από το Συμβούλιο Θεσμικής Επισκόπησης του Πανεπιστημίου της Φλόριντα (IRB-01) με αριθμό έργου IRB202201336, με όλους τους συμμετέχοντες να παρέχουν ενημερωμένη συγκατάθεση. 

Τέσσερις συμμετέχοντες (τρεις γυναίκες και ένας άνδρας) παρείχαν δείγματα αποτυπώματος άμμου και έξι συμμετέχοντες (πέντε γυναίκες και ένας άνδρας) παρείχαν δείγματα αέρα δωματίου (ομαδικός αέρας δωματίου). 

Η συμμετοχή ήταν σε εθελοντική βάση και οι συμμετέχοντες δεν έλαβαν καμία αποζημίωση.

Πριν από τη διήθηση και μεταξύ κάθε δείγματος, οι επιφάνειες του εργαστηρίου και ο εξοπλισμός διήθησης (όλος ο τυπικός εργαστηριακός εξοπλισμός που εμπλέκεται στη διαδικασία πλύσης και διήθησης, καθώς και η ίδια η αντλία διήθησης) απολυμάνθηκαν με αιθανόλη 70% και ο εξοπλισμός δειγματοληψίας (μπουκάλια συλλογής) απολυμάνθηκε (πλύθηκε καλά) με χλωρίνη 10% και ξεπλύθηκε καλά με απιονισμένο νερό.

Αμμος

1X TE—IDTE pH 8,0 1X TE Solution (Integrated DNA Technologies, αρ. κατ. 11-05-01-09) προστέθηκε σε κάθε μεμονωμένο δείγμα άμμου σε μεμονωμένους κωνικούς σωλήνες φυγοκέντρησης Falcon των 50 ml, σε περίπου δύο φορές τον όγκο της άμμου (10 ml άμμου και 20 ml 1Χ ΤΕ). 

Τα δείγματα ανακινήθηκαν απαλά με το χέρι και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε μια κουνιστή πλατφόρμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, με επιπλέον απαλή ανακίνηση με το χέρι κάθε 15 λεπτά. 

Τα δείγματα ξεκουράστηκαν έως ότου η άμμος είχε βυθιστεί στον πυθμένα κάθε σωλήνα. 

Στη συνέχεια, το υπερκείμενο μεταφέρθηκε αμέσως με σιφώνιο σε μια αποστειρωμένη σύριγγα BD luer lock των 60 ml (Fisher Scientific, αρ. κατ. 136898). 

Στη συνέχεια τα δείγματα φιλτραρίστηκαν με το χέρι χρησιμοποιώντας σύριγγες BD luer lock των 60 ml μέσω μονάδων φίλτρου πίεσης Sterivex-GP 0,22 μm (Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC) και καλύφθηκαν με καπάκια B.Braun luer lock (Medline, αρ. κατ. BMG0BTMR2). . Τελικά,

Νερό

Τα δείγματα νερού αντλήθηκαν (με το χέρι (στην Ιρλανδία) ή ηλεκτρονικά (στη Φλόριντα)) μέσω μονάδων φίλτρου πίεσης Sterivex-GP 0,22 μm (Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC) και καλύφθηκαν με καπάκια κλειδαριάς B.Braun luer (Medline, cat . αρ. BMGTMR2000B). 

Η άντληση με το χέρι έγινε με αποστειρωμένες σύριγγες BD luer lock των 60 ml. Η ηλεκτρονική άντληση έγινε με χρήση GeoTech Peristaltic Pump Series II. 

Στη συνέχεια, 740 μl ρυθμιστικού διαλύματος ATL και 60 μl Πρωτεϊνάσης Κ από κιτ Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit προστέθηκαν σε κάθε δείγμα και τοποθετήθηκαν σε κωνικούς φυγοκεντρικούς σωλήνες Falcon των 50 ml σε κυλιόμενο επωαστήρα για μια νύχτα (24-26 ώρες) στις 56 °C.

Αέρας

Για δειγματοληψία eDNA αέρα, ο αέρας δωματίου διήλθε μέσω μονάδων φίλτρου πίεσης Millipore Sterivex-GP πόρων 0,22 μm (Merk Millipore, αρ. κατ. SVGPL10RC), χρησιμοποιώντας μια αντλία κενού Welch (2019LD-4112) ή μια GeoTech Peristaltic Pump Series II. 

Το περιβαλλοντικό DNA εκχυλίστηκε 8 , 17 όπως για τα δείγματα νερού και άμμου, εκτός από το ότι προστέθηκαν μόνο 20 μl Πρωτεϊνάσης Κ ανά φίλτρο και η επώαση ρυθμιστικού διαλύματος ATL και πρωτεϊνάσης Κ στους 56 °C διεξήχθη για 1 ώρα.

Εξαγωγή και προσδιορισμός αλληλουχίας DNA

Και για τους τρεις τύπους δειγμάτων (άμμος, νερό και αέρας), μετά την επώαση στους 56 °C, τα διαλύματα του ρυθμιστικού διαλύματος ATL (μετά από διήθηση νερού ή αέρα, ή μετά από πλύση με άμμο και διήθηση), 

Πρωτεϊνάση Κ και eDNA μεταφέρθηκαν από το Sterivex- Μονάδες φίλτρου πίεσης GP σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης 2 ml χρησιμοποιώντας αποστειρωμένες σύριγγες BD Slip Tip 10 ml (Fisher Scientific, αρ. κατ. 14823434). 

Το DNA στη συνέχεια απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 8 , 17 , 83. 

Μετά την επώαση, ίσοι όγκοι 800 μl (άμμος και νερό) ρυθμιστικού διαλύματος AL και 800 μΙ (άμμος και νερό) παγωμένης αιθανόλης προστέθηκαν σε κάθε δείγμα, και στροβιλίστηκαν έντονα και φυγοκεντρήθηκαν μετά από κάθε προσθήκη. 

Για τα δείγματα αέρα, χρησιμοποιήθηκαν 400–500 µl από κάθε διάλυμα (καθώς ανακτάται μικρότερος όγκος διαλύματος ATL από τα αρχικά ξηρά φίλτρα Sterivex). 

Κάθε δείγμα φορτώθηκε σε μια στήλη DNeasy spin και φυγοκεντρήθηκε στα 6.000 g για 1 λεπτό, με τη ροή διέλευσης να απορρίπτεται μετά από κάθε περιστροφή (επαναλαμβανόμενο έως ότου όλο το περιεχόμενο κάθε δείγματος περιδινήθηκε μέσω της στήλης περιστροφής). Στη συνέχεια, προστέθηκαν 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος AW1 και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 6.000 g για 1 λεπτό. 

Στη συνέχεια, προστέθηκαν 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος AW2, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 16.000 gγια 3 λεπτά, αφαιρέθηκε το flow-through και περιστράφηκαν για επιπλέον 1 λεπτό στα 16.000 g . Το DNA εκλούστηκε με 70 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ΑΕ (επωάστηκε στους 70 °C πριν προστεθεί στη στήλη περιδίνησης), επωάστηκε στη στήλη σε θερμοκρασία δωματίου για 7 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml στα 6.000 g για 1 λεπτό . 

Η συγκέντρωση του DNA μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο ThermoScientific Nanodrop 2000 (Fisher Scientific) και τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -20 °C μέχρι την qPCR ή τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του κυνηγετικού όπλου.

Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης και η αλληλουχία του κυνηγετικού όπλου Illumina διεξήχθησαν στο Διεπιστημονικό Κέντρο για την Έρευνα Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου της Φλόριντα. 

Τέσσερα δείγματα eDNA νερού (2017) αναλύθηκαν σε ένα Illumina HiSeq 3000 και όλα τα επόμενα δείγματα Illumina (επτά νερό και δέκα eDNA άμμου) αναλύθηκαν σε ένα Illumina NovaSeq 6000 (Συμπληρωματικός Πίνακας 1 ) 8 , 1. 

Όλα τα δείγματα Nanopore της Οξφόρδης αναλύθηκαν σε ένα MinION στο εργαστήριο Duffy στο Εργαστήριο Whitney του Πανεπιστημίου της Φλόριντα για τη Θαλάσσια Βιοεπιστήμη. 

Αυτή η συσκευή δεν είχε χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για δείγματα ανθρώπου. Χρησιμοποιήσαμε έναν προσωπικό sequencer MinION αντί του προηγούμενου βασικού συστήματος αλληλουχίας υψηλής απόδοσης Illumina, καθώς υπήρχαν κάποιες αναγνώσεις ανθρώπινης ευθυγράμμισης στο δείγμα ελέγχου αρνητικού πεδίου Illumina, αν και αυτές ήταν 13 έως 38 φορές λιγότερες ανθρώπινες αναγνώσεις από αυτές που ανακτήθηκαν από περιβαλλοντικά προερχόμενο eDNA δείγματα (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). 

Οι βιβλιοθήκες MinION προετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κιτ: Oxford Nanopore Technologies (ONT) Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110, αρ. κατ. 76487-106), NEBNext Companion Module for ONT Ligation Sequencing Kit (cat. E7180S) και ONT Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004, αρ. κατ. 76487-116). 

Στη συνέχεια αναλύθηκαν η αλληλουχία τους σε ΟΝΤ Minion Flow Cells (αρ. κατ. 76487-106). 

Για τους χρόνους εκτέλεσης και το ποσοστό των διαθέσιμων πόρων, δείτε τον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 . 

Όλα τα δείγματα αλληλουχίας που σχετίζονται με τις θαλάσσιες χελώνες, συμπεριλαμβανομένων των ακατέργαστων αναγνώσεων, κατατίθενται στη βάση δεδομένων του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) με το αναγνωριστικό BioProject PRJNA449022 . Όλα τα δείγματα αλληλουχίας που σχετίζονται με το ανθρώπινο eDNA βρίσκονται στο αναγνωριστικό BioProjectPRJNA874696 .

Οι βιβλιοθήκες σύλληψης Exome κατασκευάστηκαν και αλληλουχήθηκαν στους πυρήνες UF ICBR Gene Expression και NextGen Sequencing Cores. 

Πέντε δείγματα eDNA νερού ή άμμου (τρία σκόπιμα ανθρωποκεντρικά δείγματα και δύο μάρτυρες αρνητικού πεδίου) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση σύλληψης εξωμίου Illumina DNA Prep with Enrichment, Exome Panel (αρ. κατ. 20020183, συλλαμβάνει 45 Mb εξωνικού περιεχομένου), σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή. 

Εν συντομία, το eDNA κατακερματίστηκε, οι προσαρμογείς απολινώθηκαν και ενισχύθηκαν για εννέα κύκλους και καθαρίστηκαν με σφαιρίδια Ampure XP (Beckman Coulter, αρ. κατ. Α63881). Τα πέντε δείγματα συγκεντρώθηκαν με ίσο όγκο για έναν υβριδισμό εξωμίου σύμφωνα με τον οδηγό χρήσης και ο υβριδισμός του ανιχνευτή πραγματοποιήθηκε στους 95 °C για 5 λεπτά, ένας κύκλος 1 λεπτό το καθένα, ξεκινώντας από τους 94 °C για τον πρώτο κύκλο, στη συνέχεια μείωση 2 °C ανά κύκλο για 18 κύκλους, και κράτημα για 90 λεπτά στην τελική θερμοκρασία. 

Μετά τον υβριδισμό του εξώματος, διεξήχθη η σύλληψη του ανιχνευτή, η πλύση και η έκλουση, ακολουθούμενη από εμπλουτισμό βιβλιοθήκης με δέκα κύκλους ενίσχυσης PCR. 

Η αλληλουχία εξωμάτων διεξήχθη σε μια κυψέλη ροής Illumina NovaSeq 6000 S4 για κύκλους 2× 150 bp με στόχο 50 εκατομμύρια αναγνώσεις ανά δείγμα (με τους ελέγχους αρνητικού πεδίου που αναμένεται να επιστρέψουν λιγότερες αναγνώσεις λόγω έλλειψης ανθρώπινου eDNA).

Βιοπληροφορική ανάλυση

Όλα τα βιοπληροφορικά εργαλεία χρησιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. 

Η πλατφόρμα Galaxy ( https://usegalaxy.eu/ ) χρησιμοποιήθηκε για βιοπληροφορική ανάλυση 84 , 85 , με το NanoGalaxy να χρησιμοποιείται επίσης για δεδομένα αλληλουχίας νανοπόρου 86 . 

Όλα τα δείγματα ελέγχθηκαν για ποιότητα (FastQC, v.0.73; αναφ. 87 ), οι προσαρμογείς και οι αναγνώσεις χαμηλής ποιότητας περικόπηκαν (<20 βαθμολογία ποιότητας) (Trim Galore! ( https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk /projects/trim_galore/ ) v.0.6.7 για δεδομένα HiSeq και NovaSeq· Porechop v.0.2.4 (αναφ. 88 ) για δεδομένα ακολουθίας Nanopore Oxford) και οι αναγνώσεις υψηλής ποιότητας ευθυγραμμίστηκαν (Bowtie2, v.2.4.2 Αναφ. 89) στο ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (Hg38, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=human%20genome%2038 ) (ευθυγραμμίσεις σε ζεύγη ανάγνωσης, ευθυγραμμίσεις Illumina και απλής ανάγνωσης, νανοπόρος) και ευθυγραμμισμένο (minimap2, v.2.24; αναφ. 90 ) με το πρόσφατα απελευθερωμένο πλήρες ανθρώπινο γονιδίωμα (T2T-CHM13v1.1, αναφ. 91 ). 

Τα δεδομένα νανοπόρων eDNA του αέρα που έχουν περικοπεί ευθυγραμμίστηκαν επίσης (minimap2, v.2.24; αναφ. 90 ) με τα ακόλουθα γονιδιώματα αναφοράς: πράσινη θαλάσσια χελώνα ( Chelonia mydas ) (rCheMyd1, αριθμός πρόσβασης NCBI: GCF_015237465.2 (αναφ. ) , Ch. (Αριθμός πρόσβασης NCBI: HQ878327.2 (αναφ. 93 )) και CmPV1 (αριθμοί πρόσβασης NCBI: MT179559.1, MT179558.1 και EU493091.1 ) 94 , 95 . 

Για να εξεταστούν οι ανθρώπινες γενετικές αναγνώσεις στα δείγματα νερού και άμμου, χρησιμοποιήθηκε το StringTie (v.2.1.7, αναφ. 96 ) για τον προσδιορισμό των αναγνώσεων που ευθυγραμμίζονται μόνο με το ανθρώπινο χρωμόσωμα Υ, με τη σύσταση αναγνώσεων ειδικών για το χρωμόσωμα Υ (αφθονία γονιδίου ανά δείγμα αφθονία). 

Οι συνολικές αναγνώσεις ανά δείγμα που ευθυγραμμίζονται με το ανθρώπινο χρωμόσωμα Υ ποσοτικοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας Samtools idxstats (v.2.0.4; αναφ. 97 ), χρησιμοποιώντας αρχεία ευθυγράμμισης ως είσοδο. Το ανθρώπινο χρωμόσωμα Υ επιλέχθηκε επειδή εξελίσσεται γρήγορα και επομένως μπορεί να επιβεβαιώσει την παρουσία γνήσιων ανθρώπινων αναγνώσεων 25. 

Οι συνολικές αναγνώσεις ανά δείγμα που ευθυγραμμίζονται με τις ανθρώπινες πυρηνικές και μιτοχονδριακές περιοχές ποσοτικοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας Samtools idxstats (v.2.0.4), χρησιμοποιώντας αρχεία ευθυγράμμισης ως είσοδο. 

Οι ανθρώπινες μιτοχονδριακές απλοομάδες ταξινομήθηκαν στο MitoMaster 98 , χρησιμοποιώντας Haplogrep 99 και Phylotree 17 (αναφ. 100 ), με την παθογένεια των μιτοχονδριακών παραλλαγών να προσδιορίζεται από το MitoTip 27 και το ClinGen 28 . Τα διαγράμματα απλοομάδων ανθρώπινων μιτοχονδρίων παρήχθησαν στο RStudio 101 , χρησιμοποιώντας το πακέτο web v.0.1.5 ( https://github.com/cardiomoon/webr ) και τα γραφήματα κάλυψης ανθρώπινου γονιδιώματος παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο ggplot v.3.4.0 (αναφ. 102 ).

Η πλατφόρμα ONT EPI2ME χρησιμοποιήθηκε για κλήσεις δομικών παραλλαγών και μεταγονιδιωματική, ενώ ο προσαρμογέας και η περικοπή ανάγνωσης χαμηλής ποιότητας πραγματοποιήθηκε με το Porechop. Το EPI2ME Structural Variant Caller εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους (συμπεριλαμβανομένων τουλάχιστον τριών αναγνώσεων για την υποστήριξη κάθε κλήσης), με τη μόνη εξαίρεση να είναι ένα ελάχιστο μήκος δομικής παραλλαγής 20 bp. 

Η ευθυγράμμιση έγινε με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (GRCh38, αναφ. 103 ) χρησιμοποιώντας minimap2 (αναφ. 90 ) και η κλήση δομικής παραλλαγής πραγματοποιήθηκε με Sniffles 104 , 105 . Η μεταγονιδιωματική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το What's in My Pot (v.2021.11.26), το οποίο χρησιμοποιεί Centrifuge and Dustmaker 106 , 107 , 108 .

Για τις αναλύσεις δομικών παραλλαγών στον προσδιορισμό αλληλουχίας ΟΝΤ, χρησιμοποιήσαμε το minimap v.2.17-r941 (αναφ. 90 ) για να ευθυγραμμίσουμε τις προκαθορισμένες αναγνώσεις αλληλουχίας νανοπόρου eDNA του προσαρμογέα έναντι του ανθρώπινου γονιδιώματος GRCh37 με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. 

Τα αρχεία που προέκυψαν ευρετηριάστηκαν, δυαδοποιήθηκαν και ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας samtools v.1.10 (αναφ. 97 ), ακολουθούμενη από εκτίμηση κάλυψης χαρτογράφησης με κάλυψη samtools. 

Για κλήση αναδιάταξης υψηλής ευαισθησίας, Sniffles v.2.0.7 (αναφ. 104 , 105) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση δομικών παραλλαγών σε κάθε δείγμα, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες ρυθμίσεις 'non-germline' και 'minsupport = 1' για να αυξηθεί η ευαισθησία σε ανάλυση μεμονωμένης ανάγνωσης. 

Τα αποτελέσματα μεμονωμένων εκτελέσεων χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδοι για μια δεύτερη, συνδυασμένη κλήση αναδιάταξης από την υποστήριξη εισόδου πολλαπλών δειγμάτων του Sniffles. Για τη διαλογή για γνωστές ανθρώπινες διαγραφές, οι έξοδοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη vcfR (v.1.12.0) στο R 109 . 

Οι περιοχές κλήσης διαγραφής αντιστοιχίστηκαν με τη βάση δεδομένων δομικών παραλλαγών gnomAD v.2.1 26 , χρησιμοποιώντας ένα όριο επιεικής απόστασης έως και 5% του συνολικού μήκους συμβάντος γύρω από τις θέσεις λήξης διακοπής διαγραφής 5' και 3'. 

Επαληθεύσαμε μη αυτόματα την υποστήριξη αλληλουχίας ONT των παραλλαγών αριθμού αντιγράφων που προέκυψαν χρησιμοποιώντας το IGV 110. 

Οι επισκέψεις διαγραφής οπτικοποιήθηκαν σε χάρτες χρωμοσωμάτων GRCh37 χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη chromoMap (v.4.1.1) στο R 111 . 

Η λειτουργική ομαδοποίηση των επισκέψεων γονιδίων διαγραφής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση λειτουργικού δικτύου γονιδίων HumanBase ( https://humanbase.net/ ) 112 , πρόσβαση στις 21 Οκτωβρίου 2022.

Ποσοτική PCR

Επιλέχθηκαν δύο δοκιμασίες qPCR γονιδιακής έκφρασης Taqman, προεπικυρωμένες από ανθρώπινο Applied Biosystem που στρέφονται κατά του γονιδίου LILRB2 και του γονιδίου ZNF285 (αναγνωριστικά προσδιορισμού Hs01629548_s1 και Hs00603276_s1, αντίστοιχα) για χρήση ως μη ειδικής δράσης για τον άνθρωπο. πάνω από 27 άλλα είδη από ποντίκια έως φυτά ( https://www.thermofisher.com/order/genome-database/ ; ποντίκι, αρουραίος, Arabidopsis , C. elegans, μύγα φρούτων, βοοειδές, σκύλος, κινέζικο χάμστερ, κατσίκα, μαρμοζέτα με άσπρα φουντωτά αυτιά, ινδικό χοιρίδιο, ζέβρα, άλογο, κοτόπουλο, σόγια, πίθηκος cynomolgus, πρόβατο, κουνέλι, ρύζι, πίθηκος ρέζους, μαγιά αρτοποιίας, μαγιά σχάσης, χοίρος , ψωμί σιτάρι, σταφύλι κρασιού, δυτικός βάτραχος με νύχια και καλαμπόκι) και έχουν τόσο εκκινητές όσο και ανιχνευτή σε ένα μόνο εξόνιο (δηλαδή, ανίχνευση DNA). 

Δείξαμε επίσης ότι αυτές οι δοκιμές δεν αντέδρασαν διασταυρούμενα με DNA πράσινης θαλάσσιας χελώνας ή καρέτα καρέτα (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 9β). 

Ένα πανευκαρυωτικό γονίδιο 18S rRNA (Applied Biosystem, 4352930E) προεπικυρωμένος προσδιορισμός έκφρασης γονιδίου Taqman, ο οποίος έχει επίσης εκκινητές και ανιχνευτή σε ένα μόνο εξόνιο (δηλαδή, ανιχνεύει DNA), χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του συνολικού επιπέδου παν- ευκαρυωτικού DNA σε καθένα από τα ιρλανδικά δείγματα. Το qPCR από το eDNA του αέρα, ειδικά για είδη πράσινης θαλάσσιας χελώνας, διεξήχθη ως προηγουμένως ανεπτυγμένες και επικυρωμένες δοκιμασίες που στοχεύουν το γονίδιο 16S rRNA, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης ενός συνθετικού θραύσματος γονιδίου 499 bp για τη δημιουργία τυπικής καμπύλης 8 , 17(εμπρός εκκινητήρας, TGCAAAAGCGGGAATAACAC, αντίστροφος εκκινητής, TCGCCCCAACCAAAAATATAG, ανιχνευτής με σήμανση FAM (ZEN and Iowa Black διπλά σβησμένα), CAACTATCTATACCCACTCACTCTCTAAGGACCTATAA (συντίθεται από Integrated DNA Technologies)). Για την αλληλουχία συνθετικού θραύσματος γονιδίου πράσινης θαλάσσιας χελώνας 16S rRNA, δείτε τον Συμπληρωματικό Πίνακα 7 .

Τα μίγματα αντίδρασης qPCR πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες 384 φρεατίων σε συνολικό όγκο 10 μl ανά φρεάτιο: 5 μl TaqMan Fast Advanced Master Mix (Fisher Scientific, αρ. κατ. 4444557), 3,5 μl νερού χωρίς νουκλεάση (Fisher Scientific ), 0,5 μl της αντίστοιχης ανάλυσης (μίγμα εκκινητή/ανιχνευτή, συγκέντρωση που παρέχεται από τον κατασκευαστή) και 1 μl εκμαγείου DNA (ή, για μάρτυρες χωρίς πρότυπο, επιπλέον 1 μl νερού χωρίς νουκλεάση ανά φρεάτιο). 

Ανάλογα με τον τύπο του δείγματος και τον διαθέσιμο όγκο δείγματος, κάθε βιολογικό δείγμα εκτελέστηκε σε τρία έως έξι τεχνικά αντίγραφα (τρεις τεχνικά αντίγραφα για δείγματα ιστού και τέσσερα έως έξι τεχνικά αντίγραφα για δείγματα eDNA). 

Οι έλεγχοι αρνητικού πεδίου είχαν τον ίδιο αριθμό τεχνικών αντιγράφων που εκτελέστηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα eDNA τους. 

Κανένας έλεγχος προτύπου δεν εκτελέστηκε εις τριπλούν σε κάθε πλάκα qPCR. Οι αντιδράσεις qPCR πραγματοποιήθηκαν σε Applied Biosystems QuantStudio 6 Pro (δείγματα Florida) ή Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex (ιρλανδικά δείγματα) με τις ακόλουθες παραμέτρους κύκλου: 95 °C για 20 δευτερόλεπτα για έναν κύκλο, ακολουθούμενο από 45 °C κύκλους των 95 για 1 s και 60 °C για 20 s. Τα αποτελέσματα qPCR σχεδιάστηκαν με BoxPlotR113 ( http://shiny.chemgrid.org/boxplotr/ ) με κάθε σημείο δεδομένων που εμφανίζεται. 

Τα μουστάκια Tukey (που εκτείνονται σε σημεία δεδομένων που απέχουν λιγότερο από 1,5× το εύρος του διατεταρτημορίου από το πρώτο/τρίτο τεταρτημόριο) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε διάγραμμα πλαισίου. 

Ένα πλαίσιο απεικονίζεται γραφικά ανά μεμονωμένο δείγμα, που αποτελείται από όλα τα τεχνικά αντίγραφα φρεατίων qPCR για αυτό το δείγμα. Τα βιολογικά αντίγραφα υποδηλώνονται με τα γράμματα A–D στο τέλος του ονόματος του δείγματος. Τα βιολογικά αντίγραφα δεν συγκεντρώνονται σε κανένα οικόπεδο κουτιού. κάθε δείγμα σημειώνεται με το δικό του πλαίσιο.

Δήλωση άδειας

Η δειγματοληψία που σχετίζεται με τις θαλάσσιες χελώνες διεξήχθη υπό τις άδειες της Επιτροπής Διατήρησης Ψαριών και Άγριας Ζωής της Φλόριντα και με δεοντολογική έγκριση από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Φλόριντα. βλέπε αναφ. 17 για τις πλήρεις λεπτομέρειες. 

Η δειγματοληψία που σχετίζεται με τον άνθρωπο διεξήχθη με δεοντολογική έγκριση από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης του Πανεπιστημίου της Φλόριντα (IRB-01) με αριθμό έργου IRB202201336, με όλους τους εθελοντές συμμετέχοντες να παρέχουν ενημερωμένη συγκατάθεση. 

Η δειγματοληψία στο Εθνικό Μνημείο του Φορτ Ματάνζας (Νήσος Κροταλίας) διεξήχθη βάσει άδειας της Υπηρεσίας Εθνικών Πάρκων Εσωτερικών των Ηνωμένων Πολιτειών, με αριθμό άδειας FOMA-2022-SCI-0003.

Περίληψη αναφοράς

Περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της έρευνας είναι διαθέσιμες στη σύνοψη αναφοράς χαρτοφυλακίου Nature που συνδέεται με αυτό το άρθρο.