Τα σενάρια για την προέλευση του κορωνοϊού συνεχίζονται χωρίς διακοπή. Σύμφωνα με άρθρο στην ιστοσελίδα Veterans Today ο θανατηφόρος ιός δημιουργήθηκε σε εργαστήριο στη βόρεια Καρολίνα.
Οι επιστήμονες του εργαστηρίου στο πανεπιστήμιο της βόρειας Καρολίνας, φέρεται να αντέγραψαν τον κινεζικής προέλασης ιό και να τον δοκίμασαν σε ινδικά χοιρίδια. Εκεί διαπιστώθηκε ότι τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μπορούσε να προσβάλλει τα ανθρώπινα κύτταρα και να πολλαπλασιαστεί προβάλλοντας το αναπνευστικό σύστημα.
Η VT είχε την ιστορία από την αρχή. Τώρα που η CIA είναι επίσημα επιφορτισμένη με την εύρεση μιας πηγής για το COVID, κάποιος που φταίει, το τεράστιο αμερικανικό πρόγραμμα άμυνας του βιοπολεμικού πολέμου που δημιουργεί κάθε άσχημο ιό που έχουμε δει, πιθανότατα έμπολα, σίγουρα γρίπη των χοίρων και στη συνέχεια «κατά λάθος» τους απελευθερώνει με τέτοιο τρόπο ώστε η ατζέντα της CIA να εξυπηρετείται.
Από τότε που γράφτηκε αυτό το άρθρο, αρχίσαμε να εξετάζουμε τις παγκόσμιες δραστηριότητες του αμερικανικού εργολάβου πυρηνικών / βιολογικών / χημικών, του αγαπημένου του Kushner-Trump, του Battelle, και των μυστικών εργαστηρίων τους σε όλο τον κόσμο.
Όταν ξεκινήσαμε, οι άνθρωποι μας άρχισαν να απειλούνται. Αυτό ήταν ένα σοβαρό λάθος.
Υποβάλετε αυτό το έγγραφο σε οποιονδήποτε γιατρό ή άλλο εξειδικευμένο ειδικό βιοεπιστημών. Δείτε τι λένε.
Για να μοιραστείτε αυτό το άρθρο στο FACEBOOK, ΠΑΡΑΚΑΛΩ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣΤΕ και ΠΑΡΕΤΕ αυτόν τον σύνδεσμο: https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/
Εισαγωγή
Τα παρακάτω έγγραφα δείχνουν ότι η έρευνα για τη δημιουργία του COVID 19 ξεκίνησε στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2006 και κορυφώθηκε με ένα επιτυχημένο βιο-όπλο το 2015, με εργασίες στο Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας και στο Χάρβαρντ και στο εργαστήριο της Διοίκησης Τροφίμων και Φαρμάκων στο Αρκάνσας .
Το έργο τους είχε τίτλο:
Ένα σύμπλεγμα SARS που μοιάζει με κοροναϊούς νυχτερίδας που κυκλοφορεί δείχνει δυνατότητες για ανθρώπινη εμφάνιση
Το έκαναν αυτό και περισσότερο, πολύ περισσότερο όπως θα διαβάσετε παρακάτω.
Όπως είπε ο Τραμπ, ξανά και ξανά, οι Κινέζοι συμμετείχαν.
Βασικό εργαστήριο ειδικών παθογόνων και βιοασφάλειας, Ινστιτούτο ιολογίας Wuhan, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Wuhan, Κίνα προμήθευσε τον ιό Bat Wuhan που χρησιμοποιήθηκε στην αμερικανική μελέτη. Το όνομά τους συμπεριλήφθηκε μόνο για αυτόν τον λόγο.
Το COVID 19 ήταν ένα έργο βιο-όπλων του Στρατού των ΗΠΑ για την κατασκευή μιας ασθένειας που προκαλεί πνευμονία και θα ήταν σχεδόν αδύνατο να εμβολιαστεί σε ασθενείς άνω των 40 ετών.
Η απόδειξη είναι εδώ, απλά μετακινηθείτε προς τα κάτω. Η μελέτη διεξήχθη από το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας και χρηματοδοτήθηκε από την USAID / CIA. Επέλεξε κινεζικό ιό νυχτερίδας και επέλεξε να συμπεριλάβει ιατρική εγκατάσταση στο Γουχάν επίσης.
Τώρα ξέρουμε γιατί, μια οθόνη καπνού για το φταίξιμο για ένα πρόγραμμα που η Κίνα δεν είχε καθόλου ή δεν είχε καμία σχέση, κάτι σατανικά κακό και καθαρά αμερικανικό.
Τον Νοέμβριο του 2015, δημοσιεύθηκε μια μελέτη που περιγράφει την ικανότητα παραγωγής του ιού που αντιμετωπίζουμε τώρα. Μεταξύ των πολλών συμμετεχόντων ήταν ένα εργαστήριο στο Γουχάν της Κίνας. Ήταν από την αρχή ως ένα από τα δεκάδες, κυρίως Αμερικάνα, που εργάζονται σε αυτό το έργο.
Ωστόσο, ένας βασικός συμμετέχων έμεινε έξω, το USAID. Υποψιάζεται, βαθιά, ότι το USAID είναι το μέτωπο για την αμερικανική έρευνα στον τομέα του πολέμου, όπως αυτή που έγινε στην Τιφλίδα, τη Γεωργία και αλλού, τεκμηριωμένη. Αυτή είναι η αναφορά που προσθέτει το USAID στην ομάδα χρηματοδότησης της έρευνας.
Ιστορικό αλλαγών
20 Νοεμβρίου 2015
Στην έκδοση αυτού του άρθρου που δημοσιεύθηκε αρχικά στο διαδίκτυο, οι συγγραφείς παρέλειψαν να αναγνωρίσουν μια πηγή χρηματοδότησης, τη χρηματοδότηση USAID-EPT-PREDICT από την EcoHealth Alliance, στο Z.-LS Το σφάλμα διορθώθηκε για τις εκδόσεις, PDF και HTML εκδόσεις αυτού του άρθρου .
[Σημείωση του συντάκτη: Θα παρουσιάσουμε τώρα το προκατειλημμένο άρθρο της Pravda και, κάτω από αυτό, την πραγματική μελέτη που αποδεικνύει την ικανότητα παραγωγής COVID 19, αποδεικνύοντας ότι δεν είναι ένας φυσικός ιός μια για πάντα.
Όσον αφορά ποιος έκανε αυτό, δεν είναι δική μας δουλειά, αλλά αποδεικνύουμε κατηγορηματικά ότι όταν αναφέρεται ένα κινεζικό εργαστήριο, είναι ένας μικρός παίκτης σε μια αμερικανική προσπάθεια, όπως περιγράφεται λεπτομερώς παρακάτω.
Αυτό καθιστά τη συζήτηση του εργαστηρίου Wuhan πιθανότατα συνεπάρκεια στον βιολογικό πόλεμο.
Ομοίως, όταν το περιοδικό Forbes και άλλοι δήλωσαν ότι θα μπορούσαν να αποδείξουν ότι το COVID 19 κατασκευάστηκε φυσικά, και φυσικά είχαν την ίδια πρόσβαση που έχουμε, υποψιαζόμαστε ότι αποτελούν μέρος μιας προσπάθειας παραπληροφόρησης που συνδέεται με το USAID και τον βιο-πόλεμο.
Η υποψία δεν είναι απόδειξη. Η απόδειξη είναι απόδειξη και υπάρχουν αρκετές αποδείξεις για να πνιγούν. Ευχαριστούμε τους Αμερικανούς επαγγελματίες του ιατρικού τομέα που μπήκαν στο στρατό των ΗΠΑ και τη CIA και που μας βοήθησαν να μας φέρουν εκεί που είμαστε τώρα, ένα έθνος σπασμένο… VeteransToday]
Pravda.Ru: Τέτοιο υλικό εμφανίστηκε το 2015 στον ιστότοπο του επιστημονικού περιοδικού Natura το 2015. Στη συνέχεια, οι συγγραφείς ισχυρίστηκαν ότι μετά την έλευση του ιού SARS (2002-2003) και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS), οι επιστήμονες γνώριζαν του κινδύνου μεσοειδικής μετάδοσης που θα οδηγούσε σε επιδημία μεταξύ ανθρώπων.
Επιτυχές εργαστηριακό πείραμα
Μεταξύ άλλων, η ερευνητική ομάδα μελέτησε νυχτερίδες, οι οποίοι είναι οι μεγαλύτεροι επωαστές κοροναϊών. Παρ 'όλα αυτά, οι νυχτερίδες δεν μπορούσαν να μεταδώσουν τον κοροϊό στους ανθρώπους επειδή δεν μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με ανθρώπινα κύτταρα με υποδοχείς ACE2.
Το υλικό ανέφερε επίσης ότι οι νυχτερίδες πέταλου φέρουν ένα στέλεχος SARS coronavirus που μπορεί να μεταδοθεί στους ανθρώπους. Έχει ονομαστεί ο ιός SHC014-CoV.
Για να μελετήσουν καλύτερα αυτόν τον ιό, οι επιστήμονες αντιγράφουν τον κοροναϊό και τον μολύνουν με ποντίκια εργαστηρίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ιός είναι πραγματικά ικανός να συνδεθεί με ανθρώπινα κύτταρα με υποδοχείς ACE2 και να πολλαπλασιαστεί στα κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος.
Στο ερευνητικό έργο, σημειώνεται ότι εργαστηριακά υλικά, δείγματα και εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Μολυσματικών Νόσων του Ιατρικού Ερευνητικού Στρατού. Παρόλο που δεν είναι ακόμη δυνατό να πούμε με βεβαιότητα ότι ο ιός που δοκιμάστηκε σε εργαστηριακά ποντίκια είναι ο ίδιος με τον SARS-Cove-2 coronavirus.
Πολιτική του ΝΑΤΟ
Ωστόσο, ενδιαφέροντα πράγματα μπορούν να βρεθούν σε προηγούμενα έγγραφα.
Για παράδειγμα:
- Η έκθεση δραστηριοτήτων της Συμμαχίας 2019 λέει ότι το 2019, η πρώτη θέση της Συμμαχίας στην έρευνα και ανάπτυξη ασχολήθηκε με το θέμα της ραδιοχημικής και βιολογικής προστασίας (29%), μετατοπίζοντας το φαινομενικά πιο πιεστικό πρόβλημα της Ευρώπης - την αντιτρομοκρατία (αποδείχθηκε 4 - προτεραιότητα m).
- Ένα χρόνο νωρίτερα, το 2018, η κατάσταση ήταν ακριβώς το αντίθετο: η τρομοκρατία, όπως θα έπρεπε, ήταν στην πρώτη θέση (28%) και η ραδιοχημική και βιολογική προστασία στην τέταρτη (13%).
Όπως γράφει το snitch των Βρυξελλών στο κανάλι τηλεγράφου, «δεδομένης της απουσίας ορατών λόγων για μια τόσο απότομη αλλαγή στα επιστημονικά ενδιαφέροντα, υπάρχουν δύο επιλογές και οι δύο είναι δυσάρεστες:
- ή το ΝΑΤΟ κουνάει τώρα το πέμπτο σημείο, παραπλανώντας τα δεδομένα για να δείξουμε «και πάντα προετοιμαζόμαστε για ιούς, είμαστε σύγχρονοι»
- ή ακόμα και το 2019 στη συμμαχία, ο Θεός με συγχωρεί, ήξεραν από πού προήλθε το πρόβλημα
Ναι, η πρώτη επιλογή είναι πολύ πιο πραγματική, αλλά, βλέπετε, τα γεγονότα είναι εκπληκτικά.
Πηγή: Pravda
Πρωτότυπη έρευνα 2015 χωρίς επεξεργασία
Δημοσίευσε: Ένα σύμπλεγμα που μοιάζει με SARS των κορωνοϊών νυχτερίδας που κυκλοφορεί δείχνει δυνατότητες ανθρώπινης εμφάνισης από τους Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric
Nature Medicine τόμος 21, σελίδες 1508–1513 (2015)
Διορθωτικό σε αυτό το άρθρο δημοσιεύθηκε στις 06 Απριλίου 2016
Αυτό το άρθρο έχει ενημερωθεί
Αφηρημένη
Η εμφάνιση σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κοροναϊού (SARS-CoV) και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS) -CoV υπογραμμίζει την απειλή συμβάντων μετάδοσης διαφόρων ειδών που οδηγούν σε εστίες στον άνθρωπο. Εδώ εξετάζουμε τις πιθανότητες ασθένειας ενός ιού τύπου SARS, SHC014-CoV, ο οποίος κυκλοφορεί αυτήν την περίοδο σε πληθυσμούς κινέζικων πεταλοειδών 1 . Χρησιμοποιώντας το σύστημα αντίστροφης γενετικής SARS-CoV 2 , δημιουργήσαμε και χαρακτηρίσαμε έναν χιμαιρικό ιό που εκφράζει την ακίδα του κοροναϊού νυχτερίδας SHC014 σε μια ραχοκοκαλιά SARS-CoV προσαρμοσμένη σε ποντίκι.
Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ιοί της ομάδας 2b που κωδικοποιούν την ακίδα SHC014 σε μια ραχοκοκαλιά άγριου τύπου μπορούν αποτελεσματικά να χρησιμοποιούν πολλαπλές ορθολογίες του ενζύμου II ανθρώπινης αγγειοτενσίνης υποδοχέα SARS (ACE2), να αναπαράγονται αποτελεσματικά σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα αεραγωγών και να επιτυγχάνουν τίτλους in vitro ισοδύναμους με επιδημικά στελέχη του SARS-CoV. Επιπροσθέτως, in vivo πειράματα καταδεικνύουν αντιγραφή του χιμαιρικού ιού σε πνεύμονα ποντικού με αξιοσημείωτη παθογένεση.
Η αξιολόγηση των διαθέσιμων ανοσοθεραπευτικών και προφυλακτικών τρόπων με βάση το SARS αποκάλυψε κακή αποτελεσματικότητα. Τόσο το μονοκλωνικό αντίσωμα όσο και η προσέγγιση εμβολίου απέτυχαν να εξουδετερώσουν και να προστατεύσουν από μόλυνση με CoVs χρησιμοποιώντας τη νέα πρωτεΐνη ακίδα.
Με βάση αυτά τα ευρήματα, δημιουργήσαμε συνθετικά έναν μολυσματικό ανασυνδυασμένο ιό SHC014 πλήρους μήκους και επιδεικνύουμε ισχυρή ιική αντιγραφή τόσο in vitro όσο και in vivo . Η δουλειά μας προτείνει έναν πιθανό κίνδυνο επανεμφάνισης SARS-CoV από ιούς που κυκλοφορούν επί του παρόντος σε πληθυσμούς νυχτερίδων.
Κύριος
Η εμφάνιση του SARS-CoV προκάλεσε μια νέα εποχή στη μετάδοση διαφόρων ειδών σοβαρής αναπνευστικής νόσου με την παγκοσμιοποίηση που οδηγεί σε ταχεία εξάπλωση σε όλο τον κόσμο και τεράστιο οικονομικό αντίκτυπο 3,4 . Έκτοτε, πολλά στελέχη - συμπεριλαμβανομένων των στελεχών της γρίπης Α H5N1, H1N1 και H7N9 και MERS-CoV - έχουν προκύψει από πληθυσμούς ζώων, προκαλώντας σημαντική ασθένεια, θνησιμότητα και οικονομική δυσκολία για τις πληγείσες περιοχές 5 . Αν και τα μέτρα δημόσιας υγείας μπόρεσαν να σταματήσουν την επιδημία SARS-CoV 4 , πρόσφατες μελέτες μεταγονιδιωματικών έχουν εντοπίσει αλληλουχίες στενών σχετιζόμενων με ιούς SARS που κυκλοφορούν σε κινεζικούς πληθυσμούς νυχτερίδων που μπορεί να αποτελέσουν μελλοντική απειλή 1,6 .
Ωστόσο, μόνο τα δεδομένα αλληλουχίας παρέχουν ελάχιστες πληροφορίες για τον εντοπισμό και την προετοιμασία για μελλοντικούς προ-πανδημικούς ιούς. Επομένως, για να εξετάσουμε το δυναμικό εμφάνισης (δηλαδή τη δυνατότητα μόλυνσης των ανθρώπων) των κυκλοφορούντων CoVs νυχτερίδων, δημιουργήσαμε έναν χιμαιρικό ιό που κωδικοποιεί μια νέα, ζωονοσογόνο πρωτεΐνη ακίδων CoV - από την ακολουθία RsSHC014-CoV που απομονώθηκε από κινέζικα νυχτερίδες πέταλου 1 - στο πλαίσιο της ραχοκοκαλιάς προσαρμοσμένου ποντικιού SARS-CoV. Ο υβριδικός ιός μας επέτρεψε να αξιολογήσουμε την ικανότητα της νέας πρωτεΐνης ακίδα να προκαλέσει ασθένεια ανεξάρτητα από άλλες απαραίτητες προσαρμοστικές μεταλλάξεις στον φυσικό κορμό της.
Χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, χαρακτηρίσαμε λοίμωξη CoV με τη μεσολάβηση της SHC014 spike πρωτεΐνης σε πρωτεύοντα ανθρώπινα κύτταρα αεραγωγών και in vivo και δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα των διαθέσιμων ανοσοθεραπευτικών έναντι του SHC014-CoV. Μαζί, η στρατηγική μεταφράζει δεδομένα μεταγονιδιωματικής για να βοηθήσει στην πρόβλεψη και την προετοιμασία για μελλοντικούς αναδυόμενους ιούς.
Οι αλληλουχίες του SHC014 και των σχετικών RsWIV1-CoV δείχνουν ότι αυτά τα CoV είναι οι πιο κοντινοί συγγενείς με τα επιδημικά στελέχη SARS-CoV (Εικ. 1α, β). Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές διαφορές στα 14 υπολείμματα που συνδέουν το ανθρώπινο ACE2, τον υποδοχέα για SARS-CoV, συμπεριλαμβανομένων των πέντε που είναι κρίσιμες για το εύρος ξενιστών: Y442, L472, N479, T487 και Y491 (αναφ. 7).
Στο WIV1, τρία από αυτά τα υπολείμματα ποικίλλουν από την επιδημία του στελέχους SARS-CoV Urbani, αλλά δεν αναμενόταν να μεταβάλουν τη δέσμευση στο ACE2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α, b και Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Αυτό το γεγονός επιβεβαιώνεται και από τα δύο πειράματα ψευδοτύπου που μετρούν την ικανότητα των φακών ιών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ακίδων WIV1 να εισέρχονται σε κύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινο ACE2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1) και με in vitro δοκιμασίες αντιγραφής του WIV1-CoV (αναφ. 1). Αντιθέτως, 7 από τα 14 υπολείμματα αλληλεπίδρασης ACE2 στο SHC014 είναι διαφορετικά από αυτά του SARS-CoV, συμπεριλαμβανομένων και των πέντε υπολειμμάτων κρίσιμων για το εύρος ξενιστών (Συμπληρωματικό Σχήμα 1γ και Συμπληρωματικός Πίνακας 1).
Αυτές οι αλλαγές, σε συνδυασμό με την αποτυχία ψευδοτυπικών φακών ιούς που εκφράζουν την ακίδα SHC014 να εισέλθει σε κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1δ), υποδηλώνουν ότι η ακίδα SHC014 δεν είναι ικανή να δεσμεύσει τον ανθρώπινο ACE2. Ωστόσο, παρόμοιες αλλαγές στα σχετικά στελέχη SARS-CoV είχαν αναφερθεί για να επιτρέψουν τη σύνδεση ACE2 7,8 , υποδηλώνοντας ότι απαιτείται πρόσθετη λειτουργική δοκιμή για επαλήθευση.
Επομένως, συνθέσαμε την ακίδα SHC014 στο πλαίσιο της ικανότητας αναπαραγωγής, προσαρμοσμένη με ποντίκι κορμού SARS-CoV (στη συνέχεια αναφερόμαστε στο χιμαιρικό CoV ως SHC014-MA15) για να μεγιστοποιήσουμε την ευκαιρία για μελέτες παθογένεσης και εμβολίων σε ποντίκια (Συμπληρωματικό Σχ. 2α). Παρά τις προβλέψεις τόσο από πειράματα με βάση τη δομή όσο και από πειράματα ψευδοτύπου, το SHC014-MA15 ήταν βιώσιμο και αναπαράχθηκε σε υψηλούς τίτλους σε κύτταρα Vero (Συμπληρωματικό Σχήμα 2β). Παρόμοια με το SARS, το SHC014-MA15 απαιτούσε επίσης ένα λειτουργικό μόριο ACE2 για είσοδο και θα μπορούσε να χρησιμοποιεί ορθολόγους ανθρώπινου, μοσχεύματος και νυχτερίδας ACE2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ, δ).
Για να ελέγξουμε την ικανότητα της ακίδας SHC014 να μεσολαβεί στη μόλυνση του ανθρώπινου αεραγωγού, εξετάσαμε την ευαισθησία της κυτταρικής σειράς του ανθρώπινου επιθηλιακού αεραγωγού Calu-3 2B4 (αναφ. 9) στη μόλυνση και βρήκαμε ισχυρή αναπαραγωγή SHC014-MA15, συγκρίσιμη με εκείνη του SARS-CoV Urbani (Εικ. 1γ).
Για να επεκταθούν αυτά τα ευρήματα, πρωτογενείς καλλιέργειες επιθηλιακών αεραγωγών (ΗΑΕ) μολύνθηκαν και έδειξαν ισχυρή αντιγραφή και των δύο ιών (Εικ. 1δ). Μαζί, τα δεδομένα επιβεβαιώνουν την ικανότητα των ιών με την ακίδα SHC014 να μολύνουν κύτταρα ανθρώπινων αεραγωγών και να υπογραμμίζουν την πιθανή απειλή της μετάδοσης διαφόρων ειδών του SHC014-CoV.
Σχήμα 1: Οι ιοί τύπου SARS αναπαράγονται σε ανθρώπινα κύτταρα αεραγωγών και παράγουν ίη νίνο παθογένεση.
( α ) Οι αλληλουχίες γονιδιώματος πλήρους μήκους αντιπροσωπευτικών CoV ευθυγραμμίστηκαν και χαρτογραφήθηκαν φυλογενετικά όπως περιγράφεται στις Διαδικτυακές Μέθοδοι. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων, με ετικέτα μόνο στήριγμα εκκίνησης άνω του 70%. Το δέντρο δείχνει CoVs χωρισμένο σε τρεις διαφορετικές φυλογενετικές ομάδες, που ορίζονται ως α-CoVs, β-CoVs και γ-CoVs. Τα κλασσικά συγκροτήματα υποομάδων επισημαίνονται ως 2a, 2b, 2c και 2d για τα β-CoVs και ως 1α και 1b για τα α-CoV. ( β ) Οι αλληλουχίες αμινοξέων των περιοχών S1 των αιχμών των αντιπροσωπευτικών β-CoV της ομάδας 2b, συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV, ευθυγραμμίστηκαν και χαρτογραφήθηκαν φυλογενετικά. Η γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει τις υποκαταστάσεις αμινοξέων. ( γ , δ) Ιική αντιγραφή των SARS-CoV Urbani (μαύρο) και SHC014-MA15 (πράσινο) μετά από μόλυνση κυττάρων Calu-3 2B4 ( c ) ή καλώς διαφοροποιημένων, πρωτογενών καλλιεργειών κυττάρων HAE διασύνδεσης αέρα-υγρού ( d ) με πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) 0,01 και για τους δύο τύπους κυττάρων. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε μεμονωμένα χρονικά σημεία με βιολογικά αντίγραφα ( η = 3) και για τα δύο Calu-3 και HAE πειράματα. ( e , f ) Απώλεια βάρους ( n = 9 για SARS-CoV MA15; n = 16 για SHC014-MA15) ( e ) και ιική αντιγραφή στους πνεύμονες ( n = 3 για SARS-CoV MA15; n = 4 για SHC014- MA15) ( στ) ποντικών BALB / c ηλικίας 10 εβδομάδων που έχουν μολυνθεί με 1 × 10 4 pfu προσαρμοσμένου σε ποντίκι SARS-CoV MA15 (μαύρο) ή SHC014-MA15 (πράσινο) μέσω της ενδορινικής (εντός) οδού. ( g, h ) Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες τομών πνευμόνων χρωματισμένων για αντιγόνο SARS-CoV Ν από ποντίκια μολυσμένα με SARS-CoV MA15 ( n = 3 ποντίκια) ( g ) ή SHC014-MA15 ( n = 4 ποντίκια) ( h ). Για κάθε γράφημα, η κεντρική τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση ομάδα και οι γραμμές σφάλματος καθορίζουν τις ράβδους κλίμακας sem, 1 mm.
Εικόνα πλήρους μεγέθους
Για να αξιολογήσουμε το ρόλο της ακίδας SHC014 στη διαμεσολάβηση λοίμωξης in vivo , μολύνσαμε ποντίκια BALB / c ηλικίας 10 εβδομάδων με 10 4 μονάδες σχηματισμού πλάκας (pfu) είτε SARS-MA15 είτε SHC014-MA15 (Εικ. 1e – h). Τα ζώα που μολύνθηκαν με SARS-MA15 παρουσίασαν ταχεία απώλεια βάρους και θνησιμότητα κατά 4 ημέρες μετά τη μόλυνση (dpi). Αντίθετα, η λοίμωξη SHC014-MA15 προκάλεσε σημαντική απώλεια βάρους (10%) αλλά καμία θνησιμότητα σε ποντίκια (Εικ. 1e). Η εξέταση ιικής αντιγραφής αποκάλυψε σχεδόν ισοδύναμους ιικούς τίτλους από τους πνεύμονες ποντικών που έχουν μολυνθεί με SARS-MA15 ή SHC014-MA15 (Εικ. 1στ) Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι πνεύμονες από ποντίκια μολυσμένους με SARS-MA15 εμφάνισαν έντονη χρώση τόσο στα τερματικά βρογχιόλια όσο και στο πνευμονικό παρέγχυμα 2 dpi (Εικ. 1 g), εκείνοι των ποντικών μολυσμένων με SHC014-MA15 παρουσίασαν μειωμένη χρώση αντιγόνου αεραγωγού (Εικ. 1h) · Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε έλλειμμα στη χρώση αντιγόνου στο παρεγχύμα ή στη συνολική βαθμολογία ιστολογίας,
Στη συνέχεια αναλύσαμε τη μόλυνση σε πιο ευαίσθητα, ηλικίας (12 μηνών) ζώα. Τα μολυσμένα με SARS-MA15 ζώα έχασαν γρήγορα το βάρος τους και υπέκυψαν σε λοίμωξη (Συμπληρωματικό Σχήμα 3α, β). Η λοίμωξη SHC014-MA15 προκάλεσε ισχυρή και παρατεταμένη απώλεια βάρους, αλλά είχε ελάχιστη θνησιμότητα. Οι τάσεις στα πρότυπα ιστολογίας και χρώσης αντιγόνου που παρατηρήσαμε σε νεαρά ποντίκια διατηρήθηκαν στα μεγαλύτερα ζώα (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Αποκλείσαμε την πιθανότητα ότι το SHC014-MA15 μεσολαβούσε λοίμωξη μέσω εναλλακτικού υποδοχέα με βάση πειράματα με χρήση του Ace2 - / - ποντίκια, τα οποία δεν εμφάνισαν απώλεια βάρους ή χρώση αντιγόνου μετά από λοίμωξη SHC014-MA15 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4a, b και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Μαζί, τα δεδομένα δείχνουν ότι οι ιοί με την ακίδα SHC014 είναι ικανοί να προκαλέσουν απώλεια βάρους σε ποντίκια στο πλαίσιο ενός μολυσματικού σκελετού CoV.
Δεδομένης της προκλινικής αποτελεσματικότητας των θεραπειών μονοκλωνικών αντισωμάτων Ebola, όπως το ZMApp 10 , στη συνέχεια επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε την αποτελεσματικότητα των μονοκλωνικών αντισωμάτων SARS-CoV έναντι της μόλυνσης με SHC014-MA15. Τέσσερα ευρέως εξουδετερωτικά ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν SARS-CoV spike πρωτεΐνη είχαν προηγουμένως αναφερθεί και είναι πιθανά αντιδραστήρια για ανοσοθεραπεία 11,12,13 . Εξετάσαμε την επίδραση αυτών των αντισωμάτων στην αντιγραφή του ιού (εκφραζόμενη ως ποσοστιαία αναστολή της αντιγραφής του ιού) και βρήκαμε ότι ενώ το SARS-CoV Urbani άγριου τύπου εξουδετερώθηκε έντονα και από τα τέσσερα αντισώματα σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων (Εικ. 2a-d) Η εξουδετέρωση διέφερε για SHC014-MA15. Fm6, ένα αντίσωμα που δημιουργείται από μεταλλάξεις εμφάνισης φάγου και διαφυγής 11,12, πέτυχαν μόνο επίπεδα φόντου αναστολής της αντιγραφής SHC014-MA15 (Εικ. 2α). Παρομοίως, αντισώματα 230,15 και 227,14, τα οποία προέρχονταν από κύτταρα Β μνήμης ασθενών με λοίμωξη με SARS-CoV 13, απέτυχε επίσης να αποκλείσει την αναπαραγωγή SHC014-MA15 (Εικ. 2b, c). Και για τα τρία αντισώματα, οι διαφορές μεταξύ των αλληλουχιών αμινοξέων ακίδων SARS και SHC014 αντιστοιχούσαν σε άμεσες ή παρακείμενες αλλαγές καταλοίπων που βρέθηκαν σε μεταλλάκτες διαφυγής SARS-CoV (fm6 N479R, 230.15 L443V, 227.14 K390Q / E), που πιθανώς εξηγεί την απουσία των αντισωμάτων «εξουδετερωτική δραστηριότητα κατά του SHC014. Τέλος, το μονοκλωνικό αντίσωμα 109.8 κατάφερε να επιτύχει 50% εξουδετέρωση του SHC014-MA15, αλλά μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις (10 μg / ml) (Εικ. 2d). Μαζί, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα ευρέως εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι του SARS-CoV μπορεί να έχουν μόνο οριακή αποτελεσματικότητα έναντι των αναδυόμενων στελεχών του τύπου SARS όπως το SHC014.
Σχήμα 2: Τα μονοκλωνικά αντισώματα SARS-CoV έχουν οριακή αποτελεσματικότητα έναντι των CoV που μοιάζουν με SARS.
( α - δ ) Δοκιμασίες εξουδετέρωσης που αξιολογούν την αποτελεσματικότητα (μετριέται ως μείωση του αριθμού των πλακών) μιας ομάδας μονοκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία αρχικά δημιουργήθηκαν κατά της επιδημίας SARS-CoV, κατά της μόλυνσης των κυττάρων Vero με SARS-CoV Urbani (μαύρο ) ή SHC014-MA15 (πράσινο). Τα αντισώματα που δοκιμάστηκαν ήταν fm6 ( n = 3 για Urbani, n = 5 για SHC014-MA15) 11,12 ( a ), 230,15 ( n = 3 για Urbani, n = 2 για SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 για Urbani, n = 5 για SHC014-MA15) ( c ) και 109,8 ( n = 3 για Urbani; n = 2 για SHC014-MA15) 13 ( d ). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση ομάδα και οι γραμμές σφάλματος ορίζουν το sem Σημειώστε ότι οι γραμμές σφάλματος στα κύτταρα Vero μολυσμένα με SARS-CoV Urbani στα b , c επικαλύπτονται από τα σύμβολα και δεν είναι ορατά.
Εικόνα πλήρους μεγέθους
Για να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα των υπαρχόντων εμβολίων κατά της μόλυνσης με SHC014-MA15, εμβολιάσαμε ηλικιωμένους ποντικούς με διπλά απενεργοποιημένα ολόκληρα SARS-CoV (DIV). Προηγούμενη εργασία έδειξε ότι το DIV μπορούσε να εξουδετερώσει και να προστατεύσει νεαρά ποντίκια από πρόκληση με ομόλογο ιό 14 . Ωστόσο, το εμβόλιο απέτυχε να προστατεύσει τα ηλικιωμένα ζώα στα οποία παρατηρήθηκε επίσης αυξημένη ανοσολογική παθολογία, υποδεικνύοντας την πιθανότητα βλάβης των ζώων λόγω του εμβολιασμού 15 . Εδώ βρήκαμε ότι το DIV δεν παρείχε προστασία από την πρόκληση με το SHC014-MA15 σε σχέση με την απώλεια βάρους ή τον ιικό τίτλο (Συμπληρωματικό Σχήμα 5a, b). Συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά με άλλες ετερόλογες ομάδες 2β CoVs 15, ορός από εμβολιασμένους με DIV, ηλικιωμένους ποντικούς απέτυχαν επίσης να εξουδετερώσουν το SHC014-MA15 (Συμπληρωματικό Σχήμα 5c).
Συγκεκριμένα, ο εμβολιασμός DIV οδήγησε σε ισχυρή ανοσολογική παθολογία (Συμπληρωματικός Πίνακας 4) και ηωσινοφιλία (Συμπληρωματικό Σχήμα 5d-f). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το εμβόλιο DIV δεν θα ήταν προστατευτικό έναντι μόλυνσης με SHC014 και θα μπορούσε ενδεχομένως να αυξήσει την ασθένεια στην ηλικιωμένη εμβολιασμένη ομάδα.
Σε αντίθεση με τον εμβολιασμό ποντικών με DIV, η χρήση του SHC014-MA15 ως ζωντανό, εξασθενημένο εμβόλιο έδειξε πιθανή διασταυρούμενη προστασία έναντι πρόκλησης με το SARS-CoV, αλλά τα αποτελέσματα έχουν σημαντικές επιφυλάξεις. Μολύσαμε νεαρά ποντίκια με 10 4 pfu του SHC014-MA15 και τους παρατηρήθηκε για 28 ημέρες. Στη συνέχεια αμφισβητήσαμε τα ποντίκια με SARS-MA15 την 29η ημέρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α). Η προηγούμενη μόλυνση των ποντικών με την υψηλή δόση SHC014-MA15 πρόσφερε προστασία έναντι πρόκλησης με θανατηφόρο δόση SARS-MA15, αν και υπήρχε μόνο μια ελάχιστη απόκριση εξουδετέρωσης SARS-CoV από τους αντιορούς που προήλθε 28 ημέρες μετά τη μόλυνση SHC014-MA15 ( Συμπληρωματικό Σχ. 6b, 1: 200). Ελλείψει δευτερεύουσας ενίσχυσης αντιγόνου, τα 28 dpi αντιπροσωπεύουν την αναμενόμενη κορυφή των τίτλων αντισωμάτων και υπονοούν ότι θα υπάρξει μειωμένη προστασία έναντι του SARS-CoV με την πάροδο του χρόνου 16,17. Παρόμοια αποτελέσματα που δείχνουν προστασία έναντι πρόκλησης με θανατηφόρο δόση SARS-CoV παρατηρήθηκαν σε ηλικιωμένους ποντικούς BALB / c σε σχέση με την απώλεια βάρους και την αντιγραφή του ιού (Συμπληρωματικό Σχήμα 6γ, d). Ωστόσο, η δόση μόλυνσης SHC014-MA15 των 10 4 pfu προκάλεσε απώλεια βάρους> 10% και θνησιμότητα σε ορισμένα ηλικιωμένα ζώα (Σχ. 1 και Συμπληρωματικό Σχ. 3). Διαπιστώσαμε ότι ο εμβολιασμός με χαμηλότερη δόση SHC014-MA15 (100 pfu), δεν προκάλεσε απώλεια βάρους, αλλά απέτυχε επίσης να προστατεύσει τα ηλικιωμένα ζώα από πρόκληση θανατηφόρου δόσης SARS-MA15 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6e, f). Μαζί, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η πρόκληση SHC014-MA15 μπορεί να παρέχει διασταυρούμενη προστασία έναντι του SARS-CoV μέσω διατηρημένων επιτόπων, αλλά η απαιτούμενη δόση προκαλεί παθογένεση και αποκλείει τη χρήση ως εξασθενημένο εμβόλιο.
Αφού αποδείξαμε ότι η ακίδα SHC014 έχει την ικανότητα να μεσολαβεί στη μόλυνση ανθρώπινων κυττάρων και να προκαλεί ασθένεια σε ποντίκια, στη συνέχεια συνθέσαμε έναν μολυσματικό κλώνο SHC014-CoV πλήρους μήκους με βάση την προσέγγιση που χρησιμοποιείται για το SARS-CoV (Εικ. 3α) 2 . Η αναπαραγωγή σε κύτταρα Vero δεν αποκάλυψε έλλειμμα για το SHC014-CoV σε σχέση με αυτό για το SARS-CoV (Εικ. 3b). Ωστόσο, το SHC014-CoV εξασθενεί σημαντικά ( Ρ <0,01) σε πρωτογενείς καλλιέργειες ΗΑΕ τόσο στις 24 όσο και στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση (Εικ. 3c). Ίη νίνο η μόλυνση των ποντικών δεν έδειξε σημαντική απώλεια βάρους αλλά έδειξε μειωμένη αναπαραγωγή του ιού στους πνεύμονες της πλήρους μήκους λοίμωξης SHC014-CoV, σε σύγκριση με το SARS-CoV Urbani (Εικ. 3δ, ε). Μαζί, τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη βιωσιμότητα του SHC014-CoV πλήρους μήκους, αλλά υποδηλώνουν ότι απαιτείται περαιτέρω προσαρμογή για να είναι η αντιγραφή του ισοδύναμη με αυτήν της επιδημίας SARS-CoV σε ανθρώπινα αναπνευστικά κύτταρα και σε ποντίκια.
Σχήμα 3: Το πλήρες μήκος SHC014-CoV αναπαράγεται στους ανθρώπινους αεραγωγούς, αλλά δεν διαθέτει την λοιμογόνο επιδημία SARS-CoV.
( α ) Σχηματικό του μοριακού κλώνου SHC014-CoV, ο οποίος συντέθηκε ως έξι συνεχόμενα cDNA (ονομαζόμενα SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E και SHC014F) που πλαισιώνουν από μοναδικές τοποθεσίες BglI που επέτρεψαν την κατευθυνόμενη συναρμολόγηση του πλήρους μήκους cDNA που εκφράζει ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (για 1a, 1b, spike, 3, φάκελος, μήτρα, 6-8 και νουκλεοκαψίδιο). Τα υπογραμμισμένα νουκλεοτίδια αντιπροσωπεύουν τις προεξοχές που σχηματίζονται μετά από διάσπαση ενζύμου περιορισμού. ( β , γ ) Ιική αντιγραφή του SARS-CoV Urbani (μαύρο) ή SHC014-CoV (πράσινο) μετά από μόλυνση κυττάρων Vero ( β ) ή καλά διαφοροποιημένων, πρωτογενών καλλιεργειών κυττάρων HAE διασύνδεσης αέρα-υγρού ( c) σε MOI 0,01. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε μεμονωμένα χρονικά σημεία με βιολογικά αντίγραφα ( n = 3) για κάθε ομάδα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα πείραμα και για τα κύτταρα Vero και HAE. ( d , e ) Απώλεια βάρους ( n = 3 για SARS-CoV MA15, n = 7 για SHC014-CoV, n = 6 για SARS-Urbani) ( d ) και αντιγραφή ιού στους πνεύμονες ( n = 3 για SARS-Urbani και SHC014-CoV) ( ε ) ποντικών BALB / c ηλικίας 10 εβδομάδων μολυσμένων με 1 × 10 5 pfu SARS-CoV MA15 (γκρι), SHC014-CoV (πράσινο) ή SARS-CoV Urbani (μαύρο) μέσω του στη διαδρομή. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση ομάδα και οι γραμμές σφάλματος καθορίζουν το sem **Ρ <0,01 και *** Ρ <0,001 Χρησιμοποιώντας δύο-tailed του Student t -test του επιμέρους χρονικά σημεία.
Κατά τη διάρκεια της επιδημίας του SARS-CoV, σύνδεσμοι γρήγορα μεταξύ civets παλάμη και τα στελέχη CoV που ανιχνεύθηκαν σε ανθρώπους 4 .
Βασιζόμενοι σε αυτό το εύρημα, το κοινό παράδειγμα εμφάνισης υποστηρίζει ότι η επιδημία SARS-CoV προήλθε από έναν ιό νυχτερίδας, πήδησε σε τσιγάρα και ενσωμάτωσε αλλαγές στον τομέα δέσμευσης υποδοχέα (RBD) για να βελτιώσει τη δέσμευση στο civet Ace2 (αναφ. 18)
Η επακόλουθη έκθεση σε ανθρώπους σε αγορές ζώντων ζώων επέτρεψε την ανθρώπινη μόλυνση με το στέλεχος του πριονιού, το οποίο, με τη σειρά του, προσαρμόστηκε για να γίνει το επιδημικό στέλεχος (Εικ. 4α).
Ωστόσο, φυλογενετική ανάλυση δείχνει ότι η πρώιμη ανθρώπινη στελέχη του SARS φαίνεται πιο στενά με στελέχη ρόπαλο από ό, τι σε στελέχη ζήβεθο 18 .
Ως εκ τούτου, ένα δεύτερο παράδειγμα υποστηρίζει ότι οι άμεσες bat-άνθρωπο μετάδοσης κίνησε SARS-CoV εμφάνιση και ότι civets παλάμης χρησίμευσε ως δευτερεύον ξενιστή και δεξαμενή για συνεχή μόλυνση (Εικ. 4β) 19 . Και για τα δύο παραδείγματα, η προσαρμογή των ακίδων σε έναν δευτερεύοντα ξενιστή θεωρείται αναγκαιότητα, με τις περισσότερες μεταλλάξεις να αναμένεται να συμβούν εντός της RBD, διευκολύνοντας έτσι τη βελτιωμένη μόλυνση. Και οι δύο θεωρίες υπονοούν ότι οι ομάδες CoV bat είναι περιορισμένες και ότι οι μεταλλάξεις στο εύρος του ξενιστή είναι τόσο τυχαίες όσο και σπάνιες, μειώνοντας την πιθανότητα μελλοντικών συμβάντων εμφάνισης στον άνθρωπο.
Σχήμα 4: Παραδείγματα εμφάνισης για κοροναϊούς.
Τα στελέχη Coronavirus διατηρούνται σε ομαδικές δεξαμενές που κυκλοφορούν σε πληθυσμούς νυχτερίδων. ( α , β ) Οι παραδοσιακές θεωρίες εμφάνισης SARS-CoV υποδηλώνουν ότι οι μεταλλάκτες εύρους ξενιστών (κόκκινος κύκλος) αντιπροσωπεύουν τυχαία και σπάνια περιστατικά που επιτρέπουν μόλυνση εναλλακτικών ξενιστών. Το παράδειγμα δευτερεύοντος ξενιστή ( α ) υποστηρίζει ότι ένας μη ανθρώπινος ξενιστής μολύνεται από έναν ιό προγόνου νυχτερίδας και, μέσω προσαρμογής, διευκολύνει τη μετάδοση στους ανθρώπους. επακόλουθη αναπαραγωγή σε ανθρώπους οδηγεί στο επιδημικό ιικό στέλεχος. Το άμεσο παράδειγμα ( β) προτείνει ότι η μετάδοση γίνεται μεταξύ νυχτερίδων και ανθρώπων χωρίς την απαίτηση ενός ενδιάμεσου ξενιστή · Η επιλογή στη συνέχεια πραγματοποιείται στον ανθρώπινο πληθυσμό με στενά συνδεδεμένους ιούς που αντιγράφονται σε δευτερογενή ξενιστή, επιτρέποντας τη συνεχή ιική επιμονή και προσαρμογή και στα δύο. ( γ ) Τα δεδομένα από χιμαιρικούς ιούς τύπου SARS υποστηρίζουν ότι οι ομάδες οιονεί ειδών διατηρούν πολλαπλούς ιούς ικανούς να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα χωρίς την ανάγκη μεταλλάξεων (κόκκινοι κύκλοι). Παρόλο που ενδέχεται να απαιτηθούν προσαρμογές σε δευτερεύοντες ή ανθρώπινους ξενιστές για την εμφάνιση επιδημίας, εάν οι ιοί που περιέχουν SHC014 ανασυνδυάζονται με μολυσματικούς σκελετούς CoV (κύκλοι με πράσινα περιγράμματα), τότε η επιδημία μπορεί να είναι το αποτέλεσμα στους ανθρώπους. Υφιστάμενα στοιχεία υποστήριξης δεδομένων και των τριών παραδειγμάτων.
Εικόνα πλήρους μεγέθους
Αν και η μελέτη μας δεν ακυρώνει τις άλλες οδούς εμφάνισης, υποστηρίζει ένα τρίτο παράδειγμα στο οποίο οι ομάδες CoV που κυκλοφορούν νυχτερίδες διατηρούν «έτοιμες» ακίδες πρωτεΐνες που είναι ικανές να μολύνουν ανθρώπους χωρίς μετάλλαξη ή προσαρμογή (Εικ. 4γ). Αυτή η υπόθεση απεικονίζεται από την ικανότητα ενός χιμαιρικού ιού που περιέχει την ακίδα SHC014 σε μια ραχοκοκαλιά SARS-CoV να προκαλεί ισχυρή λοίμωξη τόσο σε ανθρώπινες καλλιέργειες αεραγωγών όσο και σε ποντίκια χωρίς προσαρμογή RBD.
Σε συνδυασμό με την παρατήρηση των παθογόνων σκελετών CoV 3,20 που έχουν αναγνωριστεί προηγουμένως , τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι τα αρχικά υλικά που απαιτούνται για αναδυόμενα στελέχη τύπου SARS κυκλοφορούν επί του παρόντος σε δεξαμενές ζώων. Συγκεκριμένα, αν και το πλήρους μήκους SHC014-CoV απαιτεί πιθανώς επιπλέον προσαρμογή στη ραχοκοκαλιά για τη μεσολάβηση της ανθρώπινης νόσου, τα τεκμηριωμένα συμβάντα ανασυνδυασμού υψηλής συχνότητας σε οικογένειες CoV υπογραμμίζουν την πιθανότητα μελλοντικής εμφάνισης και την ανάγκη για περαιτέρω προετοιμασία.
Μέχρι σήμερα, οι οθόνες γονιδιωματικής των ζωικών πληθυσμών έχουν χρησιμοποιηθεί κατά κύριο λόγο για τον εντοπισμό νέων ιών στις ρυθμίσεις εστίας 21 . Η προσέγγιση εδώ επεκτείνει αυτά τα σύνολα δεδομένων για να εξετάσει τα ζητήματα της ιογενούς εμφάνισης και της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Θεωρούμε ότι οι ιοί με το SHC014 αυξάνουν μια πιθανή απειλή λόγω της ικανότητάς τους να αναπαράγονται σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων αεραγωγών, το καλύτερο διαθέσιμο μοντέλο για ανθρώπινη νόσο. Επιπλέον, η παρατηρούμενη παθογένεση σε ποντίκια δείχνει την ικανότητα των ιών που περιέχουν SHC014 να προκαλούν ασθένεια σε μοντέλα θηλαστικών, χωρίς προσαρμογή RBD.
Συγκεκριμένα, ο διαφορικός τροπισμός στον πνεύμονα σε σύγκριση με αυτόν με το SARS-MA15 και η εξασθένιση του πλήρους μήκους SHC014-CoV σε καλλιέργειες HAE σε σχέση με το SARS-CoV Urbani υποδηλώνουν ότι παράγοντες πέραν της δέσμευσης ACE2 - συμπεριλαμβανομένης της επεξεργασίας ακίδων, της βιοδιαθεσιμότητας των υποδοχέων ή του ανταγωνισμού των ανοσολογικών αντιδράσεων του ξενιστή - μπορεί να συμβάλει στην εμφάνιση. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω δοκιμή σε μη ανθρώπινα πρωτεύοντα για τη μετάφραση αυτών των ευρημάτων στο παθογόνο δυναμικό των ανθρώπων.
Είναι σημαντικό ότι η αποτυχία των διαθέσιμων θεραπευτικών ορίζει μια κρίσιμη ανάγκη για περαιτέρω μελέτη και για την ανάπτυξη θεραπειών. Με αυτές τις γνώσεις, μπορούν να παραχθούν προγράμματα επιτήρησης, διαγνωστικά αντιδραστήρια και αποτελεσματικές θεραπείες που είναι προστατευτικές έναντι της εμφάνισης CoV ειδικών ομάδων 2b, όπως το SHC014, και αυτά μπορούν να εφαρμοστούν σε άλλους κλάδους CoV που διατηρούν παρόμοια ετερογενή αποθέματα.
Εκτός από την προσφορά προετοιμασίας για μελλοντικούς αναδυόμενους ιούς, αυτή η προσέγγιση πρέπει να εξεταστεί στο πλαίσιο της αμερικανικής κυβέρνησης παύσης στις μελέτες κέρδους-λειτουργίας (GOF) 22 .
Με βάση τα προηγούμενα μοντέλα εμφάνισης (Εικ. 4a, b), η δημιουργία χιμαιρικών ιών όπως το SHC014-MA15 δεν αναμενόταν να αυξήσει την παθογένεια. Παρόλο που το SHC014-MA15 εξασθενεί σε σχέση με το προσαρμοσμένο γονικό ποντίκι SARS-CoV του, παρόμοιες μελέτες που εξετάζουν την παθογένεια των CoV με την άγρια τύπου Urbani ακίδα εντός της ραχοκοκαλιάς ΜΑ15 δεν έδειξαν απώλεια βάρους σε ποντίκια και μειωμένο ιικό πολλαπλασιασμό 23 . Έτσι, σε σχέση με την ακίδα Urbani – MA15 CoV, το SHC014-MA15 εμφανίζεται ξανά σε παθογένεση (Εικ. 1).
Με βάση αυτά τα ευρήματα, επιστημονικά πάνελ αναθεώρησης μπορεί να θεωρήσουν παρόμοιες μελέτες που χτίζουν χιμαιρικούς ιούς που βασίζονται σε στελέχη που κυκλοφορούν πολύ επικίνδυνα για να ακολουθήσουν, καθώς η αυξημένη παθογένεια σε μοντέλα θηλαστικών δεν μπορεί να αποκλειστεί.
Σε συνδυασμό με περιορισμούς σε προσαρμοσμένα σε ποντίκια στελέχη και στην ανάπτυξη μονοκλωνικών αντισωμάτων χρησιμοποιώντας μεταλλάγματα διαφυγής, η έρευνα για την εμφάνιση του CoV και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα μπορεί να είναι σημαντικά περιορισμένη. Μαζί, αυτά τα δεδομένα και οι περιορισμοί αντιπροσωπεύουν ένα σταυροδρόμι των ερευνητικών προβληματισμών του GOF. Η δυνατότητα προετοιμασίας και μετριασμού των μελλοντικών εστιών πρέπει να σταθμίζεται έναντι του κινδύνου δημιουργίας πιο επικίνδυνων παθογόνων. Κατά την ανάπτυξη πολιτικών που προχωρούν, είναι σημαντικό να ληφθεί υπόψη η αξία των δεδομένων που παράγονται από αυτές τις μελέτες και εάν αυτοί οι τύποι μελετών χιμαιρικών ιών δικαιολογούν περαιτέρω διερεύνηση έναντι των εγγενών κινδύνων.
Συνολικά, η προσέγγισή μας έχει χρησιμοποιήσει μεταγονιδιωματικά δεδομένα για να εντοπίσει μια πιθανή απειλή που δημιουργεί το CoV SHC014 που μοιάζει με SARS που κυκλοφορεί. Λόγω της ικανότητας των χιμαιρικών ιών SHC014 να αναπαράγονται σε καλλιέργειες ανθρώπινων αεραγωγών, να προκαλούν παθογένεση in vivo και να ξεφεύγουν από τις τρέχουσες θεραπευτικές ουσίες , υπάρχει ανάγκη τόσο επιτήρησης όσο και βελτιωμένης θεραπευτικής αγωγής κατά των κυκλοφορούντων ιών SARS. Η προσέγγισή μας ξεκλειδώνει επίσης τη χρήση δεδομένων μεταγονιδιωματικής για την πρόβλεψη της ιογενούς εμφάνισης και την εφαρμογή αυτής της γνώσης κατά την προετοιμασία για τη θεραπεία μελλοντικών αναδυόμενων ιών μολύνσεων.
Μέθοδοι
Ιοί, κύτταρα, λοίμωξη in vitro και δοκιμασίες πλάκας
Τα άγρια τύπου SARS-CoV (Urbani), προσαρμοσμένα σε ποντίκια SARS-CoV (MA15) και χιμαιρικά CoS τύπου SARS καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα Vero E6 (που ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Μολυσματικών Νόσων του Ιατρικού Ερευνητικού Στρατού των Ηνωμένων Πολιτειών), που αναπτύχθηκαν στο τροποποιημένο Eagle's του Dulbecco μέσο (DMEM) (Gibco, CA) και 5% ορός εμβρυϊκού κλώνου (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) μαζί με αντιβιοτικό / αντιμυκητικό (Gibco, Carlsbad, CA). Κύτταρα DBT (εργαστήριο Baric, άγνωστη πηγή) που έχουν εκφράσει ορθολόγους ACE2 έχουν προηγουμένως περιγραφεί τόσο για τον άνθρωπο όσο και για τους πολίτες. Η ακολουθία bat Ace2 βασίστηκε σε αυτήν από το Rhinolophus leschenaulti , και τα κύτταρα DBT που εκφράζουν το ρόπαλο Ace2 δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 8 .
Τα πειράματα ψευδοτύπου ήταν παρόμοια με εκείνα που χρησιμοποιούν ψευδοϊό με βάση τον HIV, που παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 10 και εξετάστηκαν σε κύτταρα HeLa (Ινστιτούτο ιολογίας Wuhan) που εξέφραζαν ορθολόγους ACE2 . Τα κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) (Gibco, CA) συμπληρωμένο με 10% FCS (Gibco, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως 24 .
Οι καμπύλες ανάπτυξης στα Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 και πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινων αεραγωγών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 8,25 . Κανένα από τα αποθέματα κυτταρικής γραμμής εργασίας δεν πιστοποιήθηκε ή δοκιμάστηκε πρόσφατα για μυκόπλασμα, αν και τα αρχικά αποθέματα σπόρων που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των αποθεμάτων εργασίας δεν είναι μολυσμένα. Ανθρώπινοι πνεύμονες για καλλιέργειες HAE προήλθαν από το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στα εγκεκριμένα πρωτόκολλα του Chapel Hill. Οι καλλιέργειες ΗΑΕ αντιπροσωπεύουν πολύ διαφοροποιημένο ανθρώπινο επιθήλιο αεραγωγών που περιέχει επιθηλιακά κύτταρα που δεν έχουν πηκτωματοποιημένα και μη πηκτωματοποιημένα κύτταρα καθώς επίσης και κύτταρα κυττάρων. Οι καλλιέργειες αναπτύσσονται επίσης σε μια διεπαφή αέρα-υγρού για αρκετές εβδομάδες πριν από τη χρήση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 26 .
Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και εμβολιάστηκαν με τον ιό ή αραιώθηκαν ψευδώς σε PBS για 40 λεπτά στους 37 ° C. Μετά τον εμβολιασμό, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές και προστέθηκε ένα νέο μέσο για να δηλώσει τον χρόνο «0». Τρία ή περισσότερα βιολογικά αντίγραφα συλλέχθηκαν σε κάθε περιγραφόμενο χρονικό σημείο. Δεν χρησιμοποιήθηκε τύφλωση σε καμία συλλογή δειγμάτων ούτε τυχαιοποιήθηκαν δείγματα. Όλα καλλιέργεια ιού πραγματοποιήθηκε σε ένα επίπεδο βιοασφάλειας (BSL) 3 εργαστήριο με περιττές ανεμιστήρες στα ντουλάπια βιοασφάλειας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από την ομάδα μας 2 . Όλο το προσωπικό φόρεσε αναπνευστήρες καθαρισμού αέρα (Breathe Easy, 3M) με κοστούμια Tyvek, ποδιές και μποτάκια και ήταν διπλά γάντια.
Ομαδοποίηση ακολουθιών και διαρθρωτική μοντελοποίηση.
Οι γενομικές αλληλουχίες πλήρους μήκους και οι αλληλουχίες αμινοξέων των τομέων S1 της ακμής των αντιπροσωπευτικών CoV λήφθηκαν από το Genbank ή το Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), ευθυγραμμισμένο με το ClustalX και φυλογενετικά συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας εκτίμηση μέγιστης πιθανότητας χρησιμοποιώντας 100 bootstraps ή από χρησιμοποιώντας το πακέτο PhyML , αντίστοιχα. Το δέντρο δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέγιστη πιθανότητα με το πακέτο PhyML. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων. Επισημαίνονται μόνο κόμβοι με υποστήριξη bootstrap άνω του 70%.
Το δέντρο δείχνει ότι τα CoV χωρίζονται σε τρεις διαφορετικές φυλογενετικές ομάδες που ορίζονται ως α-CoVs, β-CoVs και γ-CoVs. Τα κλασσικά συγκροτήματα υποομάδων επισημαίνονται ως 2a, 2b, 2c και 2d για β-CoVs, και 1a και 1b για τα α-CoV. Τα δομικά μοντέλα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) για τη δημιουργία ομολογικών μοντέλων για SHC014 και Rs3367 του SARS RBD σε συγκρότημα με ACE2 βασισμένο σε κρυσταλλική δομή 2AJF (Protein Data Bank). Ομολογία μοντέλα οπτικοποιήθηκαν και χειριστήκαν σε MacPyMol (έκδοση 1.3).
Κατασκευή χιμαιρικών ιών τύπου SARS.
Τόσο οι ιοί άγριου τύπου όσο και οι χιμαιρικοί ιοί προήλθαν είτε από SARS-CoV Urbani είτε από τον αντίστοιχο προσαρμοσμένο με ποντίκι (SARS-CoV MA15) μολυσματικό κλώνο (ic) όπως περιγράφηκε προηγουμένως 27 .
Τα πλασμίδια που περιείχαν ακίδες αλληλουχίας για SHC014 εκχυλίσθηκαν με περιοριστική πέψη και απολινώθηκαν στο Ε και F πλασμίδιο του ΜΑ15 μολυσματικού κλώνου. Ο κλώνος σχεδιάστηκε και αγοράστηκε από τη Bio Basic ως έξι συνεχόμενα cDNA χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες αλληλουχίες πλαισιωμένες από μοναδικές θέσεις ενδονουκλεάσης περιορισμού κατηγορίας II (BglI). Στη συνέχεια, πλασμίδια που περιείχαν θραύσματα γονιδιώματος άγριου τύπου, χιμαιρικού SARS-CoV και SHC014-CoV ενισχύθηκαν, αποκόπηκαν, απολινώθηκαν και καθαρίστηκαν.
Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις μεταγραφής ίη vitro για τη σύνθεση γενωμικού RNA πλήρους μήκους, το οποίο επιμολύνθηκε σε κύτταρα Vero Ε6 όπως περιγράφηκε προηγουμένως 2 . Το μέσο από επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως αποθέματα σπόρων για επακόλουθα πειράματα. Οι χιμαιρικοί και πλήρεις ιοί επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας πριν από τη χρήση σε αυτές τις μελέτες. Η συνθετική κατασκευή του χιμαιρικού μεταλλάγματος και του πλήρους μήκους SHC014-CoV εγκρίθηκε από την επιτροπή θεσμικής βιοασφάλειας του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας και την επιτροπή έρευνας διπλής χρήσης της ανησυχίας.
Δήλωση δεοντολογίας
Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις για τη φροντίδα και τη χρήση των ζώων από το Γραφείο Εργαστηριακής Προστασίας των Ζώων (OLAW), NIH. Η Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης των Ζώων (IACUC) του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill (UNC, Άδεια Α-3410-01) ενέκρινε το πρωτόκολλο μελέτης για τα ζώα (IACUC # 13-033) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτές τις μελέτες.
Μολύνσεις ποντικών και in vivo
Θηλυκά ποντίκια BALB / cAnNHsD ηλικίας 10 εβδομάδων και 12 μηνών παραγγέλθηκαν από τα Harlan Laboratories. Οι μολύνσεις ποντικού έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 20 . Εν συντομία, τα ζώα μεταφέρθηκαν σε εργαστήριο BSL3 και αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για 1 εβδομάδα πριν από τη μόλυνση. Για εμβολιασμό και εμβολιασμό ζωντανών εξασθενημένων ιών, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με μείγμα κεταμίνης και ξυλαζίνης και μολύνθηκαν ενδορινικά, όταν προκλήθηκαν, με 50 μl αλατούχου διαλύματος φωσφορικού (PBS) ή αραιωμένο ιό με τρία ή τέσσερα ποντίκια ανά χρονικό σημείο, ανά ομάδα λοίμωξης ανά δόση όπως περιγράφεται στο σχήμα των θρύλων.
Για μεμονωμένα ποντίκια, σημειώσεις για λοίμωξη συμπεριλαμβανομένης της αποτυχίας εισπνοής ολόκληρης της δόσης, διοχέτευση εμβολίου από τη μύτη ή μόλυνση μέσω του στόματος μπορεί να έχουν οδηγήσει σε αποκλεισμό δεδομένων ποντικιού κατά την κρίση του ερευνητή. μετά τη μόλυνση, δεν καθορίζονται άλλα προκαθορισμένα κριτήρια αποκλεισμού ή ένταξης. Δεν χρησιμοποιήθηκε τύφλωση σε πειράματα σε ζώα και τα ζώα δεν τυχαιοποιήθηκαν. Για εμβολιασμό, νεαρά και ηλικιωμένα ποντίκια εμβολιάστηκαν με ένεση πέλματος με όγκο 20 μl είτε 0,2 μg διπλού αδρανοποιημένου εμβολίου SARS-CoV με στυπτηρία ή πλαστό PBS. Τα ποντίκια στη συνέχεια ενισχύθηκαν με το ίδιο σχήμα 22 ημέρες αργότερα και προκλήθηκαν 21 ημέρες μετά.
Για όλες τις ομάδες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο, τα ζώα παρακολουθούνταν καθημερινά για κλινικά συμπτώματα ασθένειας (καμπούρα, αναστατωμένη γούνα και μειωμένη δραστηριότητα) για τη διάρκεια του πειράματος. Η απώλεια βάρους παρακολουθήθηκε καθημερινά για τα πρώτα 7 d, μετά από τα οποία η παρακολούθηση του βάρους συνεχίστηκε έως ότου τα ζώα ανέκαμψαν στο αρχικό τους αρχικό βάρος ή εμφάνισαν αύξηση βάρους συνεχώς για 3 d.
Όλα τα ποντίκια που έχασαν περισσότερο από το 20% του αρχικού τους σωματικού βάρους τρέφονταν με τροφή στο έδαφος και παρακολουθούνταν περαιτέρω πολλές φορές την ημέρα, αρκεί να ήταν κάτω από το όριο του 20%. Ποντίκια που έχασαν περισσότερο από το 30% του αρχικού τους σωματικού βάρους θυσιάστηκαν αμέσως σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Οποιοδήποτε ποντίκι που θεωρήθηκε κακό ή απίθανο να ανακάμψει θυσιάστηκε επίσης ανθρώπινα κατά την κρίση του ερευνητή. Η ευθανασία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υπερδοσολογία με ισοφλουράνιο και ο θάνατος επιβεβαιώθηκε με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας. Όλες οι μελέτες ποντικών πραγματοποιήθηκαν στο Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας (Animal Welfare Assurance # A3410-01) χρησιμοποιώντας πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Θεραπείας και Χρήσης των Ινστιτούτων των Ηνωμένων Εθνών (IACUC).
Ιστολογική ανάλυση.
Ο αριστερός πνεύμονας απομακρύνθηκε και βυθίστηκε σε 10% ρυθμισμένης φορμαλίνης (Fisher) χωρίς πληθωρισμό για 1 εβδομάδα. Οι ιστοί ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και τα τμήματα των 5 μm προετοιμάστηκαν από την κεντρική εγκατάσταση ιστοπαθολογίας του UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Για να προσδιοριστεί η έκταση της χρώσης αντιγόνου, τομές χρωματίστηκαν για ιικό αντιγόνο χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-νουκλεοκαψιδίου SARS-CoV (Imgenex) και βαθμολογήθηκε με τυφλό τρόπο με χρώση του αεραγωγού και του παρεγχύματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως 20 . Οι εικόνες τραβήχτηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Olympus BX41 με κάμερα Olympus DP71.
Δοκιμές εξουδετέρωσης ιών.
Δοκιμασίες τίτλου εξουδετέρωσης μείωσης πλάκας πραγματοποιήθηκαν με προηγουμένως χαρακτηρισμένα αντισώματα έναντι SARS-CoV, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 11,
12,13
. Εν συντομία, τα εξουδετερωτικά αντισώματα ή ορός αραιώθηκαν διαδοχικά δύο φορές και επωάστηκαν με 100 pfu των διαφορετικών μολυσματικών κλώνων, στελέχη SARS-CoV για 1 ώρα στους 37 ° C. Ο ιός και τα αντισώματα στη συνέχεια προστέθηκαν σε τρυβλίο 6 φρεατίων με 5 × 10 5 Vero Ε6 κύτταρα / φρεάτιο με πολλαπλά αντίγραφα ( n ≥ 2). Μετά από επώαση 1 ώρας στους 37 ° C, τα κύτταρα επικαλύφθηκαν με 3 ml αγαρόζης 0,8% σε ένα μέσο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ημέρες στους 37 ° C, βάφτηκαν με ουδέτερο κόκκινο για 3 ώρες και μετρήθηκαν πλάκες. Το ποσοστό μείωσης της πλάκας υπολογίστηκε ως (1 - (αριθμός πλακών με αντίσωμα / αριθμός πλακών χωρίς αντίσωμα)) × 100.
Στατιστική ανάλυση
Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε αντίθεση με δύο πειραματικές ομάδες (είτε δύο ιούς, είτε εμβολιασμένες και μη εμβολιασμένες ομάδες). Ως εκ τούτου, σημαντικές διαφορές στη βαθμολογία του ιού και στην βαθμολογία της ιστολογίας καθορίστηκαν από τη δοκιμή t -Student του διπλού άκρου σε μεμονωμένα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα κατανεμήθηκαν κανονικά σε κάθε ομάδα που συγκρίθηκε και είχαν παρόμοια διακύμανση.
Βιοασφάλεια και βιοασφάλεια
Οι αναφερόμενες μελέτες ξεκίνησαν μετά την έγκριση του πειραματικού πρωτοκόλλου από την Επιτροπή Θεσμικής Βιοασφάλειας του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας (Τίτλος Έργου: Δημιουργία μολυσματικών κλώνων CoV που μοιάζουν με SARS νυχτερίδας, Αναγνωριστικό σχεδίου ασφάλειας εργαστηρίου: 20145741; Πρόγραμμα G ID: 12279)
Αυτές οι μελέτες ξεκίνησαν πριν από την Παύση Χρηματοδότησης Έρευνας για τη Διαβιβαστική Διαδικασία της Κυβέρνησης των ΗΠΑ σχετικά με την Επιλεγμένη Έρευνα Gain-of-Function που περιλαμβάνει Ιούς Γρίπης, MERS και SARS . Αυτό το έγγραφο έχει αναθεωρηθεί από τον οργανισμό χρηματοδότησης, το NIH Ζητήθηκε συνέχιση αυτών των μελετών και αυτό έχει εγκριθεί από το NIH.
Το SARS-CoV είναι επιλεγμένος πράκτορας. Όλες οι εργασίες για αυτές τις μελέτες πραγματοποιήθηκαν με εγκεκριμένες τυπικές διαδικασίες λειτουργίας (SOP) και συνθήκες ασφαλείας για SARS-CoV, MERs-CoV και άλλους σχετικούς CoV. Οι θεσμικές εγκαταστάσεις μας CoV BSL3 έχουν σχεδιαστεί για να συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις ασφαλείας που συνιστώνται στα εργαστήρια βιοασφάλειας μικροβιολογικών και βιοϊατρικών (BMBL), στο Υπουργείο Υγείας και Ανθρώπινης Υπηρεσίας των ΗΠΑ, στην Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας, στα Κέντρα Ελέγχου Νόσων (CDC) ) και το NIH. Υποβλήθηκαν σχέδια εργαστηριακής ασφάλειας και η εγκατάσταση έχει εγκριθεί για χρήση από το Τμήμα Περιβαλλοντικής Υγείας και Ασφάλειας του ΟΗΕ (EHS) και το CDC. Απαιτείται πρόσβαση ηλεκτρονικής κάρτας για είσοδο στην εγκατάσταση.
Όλοι οι εργαζόμενοι έχουν εκπαιδευτεί από την EHS για ασφαλή χρήση αναπνευστικών συσκευών καθαρισμού αέρα (PAPRs), και εφαρμόζονται κατάλληλες εργασιακές συνήθειες σε εγκαταστάσεις BSL3 και υπάρχουν ενεργά σχέδια ιατρικής παρακολούθησης. Οι εγκαταστάσεις μας CoV BSL3 περιέχουν εφεδρικούς ανεμιστήρες, ισχύ έκτακτης ανάγκης στους ανεμιστήρες και βιολογικά ντουλάπια ασφαλείας και καταψύκτες, και οι εγκαταστάσεις μας μπορούν να φιλοξενήσουν SealSafe ποντίκια. Τα υλικά που ταξινομούνται ως παράγοντες BSL3 αποτελούνται από SARS-CoV, πρόδρομα στελέχη CoV bat, MERS-CoV και μεταλλάγματα που προέρχονται από αυτά τα παθογόνα. Μέσα στις εγκαταστάσεις BSL3, ο πειραματισμός με έναν μολυσματικό ιό πραγματοποιείται σε πιστοποιημένο θάλαμο βιοασφάλειας κατηγορίας II (BSC).
Όλα τα μέλη του προσωπικού φορούν τρίψιμο, κοστούμια και ποδιές Tyvek, PAPR και καλύμματα παπουτσιών και τα χέρια τους είναι διπλά γάντια. Οι χρήστες του BSL3 υπόκεινται σε σχέδιο ιατρικής παρακολούθησης που παρακολουθείται από την Ιατρική Κλινική Υπαλλήλων Εργαζομένων στο Πανεπιστήμιο (UEOHC), το οποίο περιλαμβάνει έναν ετήσιο φυσικό, ετήσιο εμβολιασμό γρίπης και υποχρεωτική αναφορά τυχόν συμπτωμάτων που σχετίζονται με λοίμωξη CoV κατά τη διάρκεια περιόδων που εργάζονται στο BSL3. Όλοι οι χρήστες BSL3 εκπαιδεύονται στη διαχείριση της έκθεσης και στα πρωτόκολλα αναφοράς, είναι προετοιμασμένοι να αυτο-καραντίνα και έχουν εκπαιδευτεί για ασφαλή παράδοση σε ένα τοπικό τμήμα διαχείρισης μολυσματικών ασθενειών σε περίπτωση έκτακτης ανάγκης. Όλα τα πιθανά συμβάντα έκθεσης αναφέρονται και διερευνώνται από το EHS και το UEOHC, με αναφορές που υποβάλλονται τόσο στο CDC όσο και στο NIH.
Κωδικοί προσχώρησης
Προσχωρήσεις
Protein Data Bank
- 2AJF
Ιστορικό αλλαγών
20 Νοεμβρίου 2015
Στην έκδοση αυτού του άρθρου που δημοσιεύθηκε αρχικά στο διαδίκτυο, οι συγγραφείς παρέλειψαν να αναγνωρίσουν μια πηγή χρηματοδότησης, τη χρηματοδότηση USAID-EPT-PREDICT από την EcoHealth Alliance, στο Z.-LS Το σφάλμα διορθώθηκε για τις εκδόσεις, PDF και HTML εκδόσεις αυτού του άρθρου .
βιβλιογραφικές αναφορές
- Ge, XY et αϊ. Απομόνωση και χαρακτηρισμός ενός κοροναϊού τύπου SAR με ρόπαλο που χρησιμοποιεί τον υποδοχέα ACE2. Φύση 503 , 535–538 (2013).
- Yount, Β. Et αϊ. Αντίστροφη γενετική με μολυσματικό cDNA πλήρους μήκους σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κοροναϊού. Proc. Νατλ. Acad. Sci. ΗΠΑ 100 , 12995–13000 (2003).
Becker, MM et al. Το συνθετικό ανασυνδυασμένο κοροναϊκό που μοιάζει με SARS νυχτερίδας είναι μολυσματικό σε καλλιεργημένα κύτταρα και σε ποντίκια. Proc. Νατλ. Acad. Sci. ΗΠΑ 105 , 19944-19949 (2008).
- Peiris, JS, Guan, Y. & Yuen, KY Σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο. Nat. Med. 10 , S88-S97 (2004).
- Al-Tawfiq, JA et al. Επιτήρηση για αναδυόμενους αναπνευστικούς ιούς. Lancet Infect. Δρ. 14 , 992-1000 (2014).
- He, Β. Et αϊ. Προσδιορισμός διαφορετικών αλφακοροναϊών και γονιδιωματικός χαρακτηρισμός ενός νέου σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου, όπως κοροναϊού από νυχτερίδες στην Κίνα. J. Virol. 88 , 7070–7082 (2014).
- Αρθρο
- Μελετητής Google
- Li, F. Αναγνώριση υποδοχέα και μολύνσεις διαφόρων ειδών του κοροναϊού SARS. Αντιιικό Res. 100 , 246–254 (2013).
- Sheahan, Τ. Et al. Μηχανισμοί επέκτασης του ξενιστή του ζωονοσογόνου σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κορανοϊού στο επιθήλιο των ανθρώπινων αεραγωγών. J. Virol. 82 , 2274–2285 (2008).
- Yoshikawa, Τ. Et al. Δυναμικές έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων σε σοβαρή οξεία αναπνευστική σύνδρομο που σχετίζεται με λοίμωξη από κοροϊό. PLoS ONE 5 , e8729 (2010).
- Qiu, X. et αϊ. Αντιστροφή προχωρημένης νόσου του ιού Έμπολα σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου με ZMapp. Nature 514 , 47–53 (2014).
- Sui, J. et αϊ. Διεύρυνση της δραστηριότητας εξουδετέρωσης για άμεσο αποκλεισμό μιας κυρίαρχης οδού εξέλιξης SARS-coronavirus που βασίζεται σε αντισώματα. PLoS Pathog. 4 , e1000197 (2008).
- Sui, J. et αϊ. Επιδράσεις των ανθρώπινων αντισωμάτων της δέσμευσης υποδοχέα πρωτεΐνης κατά των ακίδων στο σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο εξουδετέρωσης και φυσικής κατάστασης εξουδετέρωσης του κορανοϊού. J. Virol. 88 , 13769–13780 (2014).
- Αρθρο
- Μελετητής Google
- Rockx, Β. Et αϊ. Αποδράστε από επιδράσεις εξουδετέρωσης ανθρώπινου μονοκλωνικού αντισώματος in vitro και in vivo καταλληλότητα σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κοροναϊού. J. Infect. Δρ. 201 , 946–955 (2010).
- Spruth, Μ. Et αϊ. Ένα διπλό αδρανοποιημένο υποψήφιο εμβόλιο SARS κοροναϊού διεγείρει εξουδετερωτικές και προστατευτικές αποκρίσεις αντισωμάτων. Εμβόλιο 24 , 652–661 (2006).
- Bolles, Μ. Et αϊ. Ένα διπλό απενεργοποιημένο εμβόλιο σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου κοροναϊού παρέχει ελλιπή προστασία σε ποντίκια και προκαλεί αυξημένη ηωσινοφιλική προφλεγμονώδη πνευμονική απόκριση μετά από πρόκληση. J. Virol. 85 , 12201–12215 (2011).
- Siegrist, C.-A. στο Vaccines 6th edn. (επιμ. Plotkin, SA, Orenstein, WA & Offit, PA) 14–32 (WB Saunders, 2013).
- Deming, D. et al. Η αποτελεσματικότητα του εμβολίου σε ποντίκια γήρανσης αμφισβητήθηκε με ανασυνδυασμένη SARS-CoV που φέρει επιδημία και παραλλαγές ζωονόσου. PLoS Med. 3 , e525 (2006).
- Graham, RL, Donaldson, EF & Baric, RS Μια δεκαετία μετά το SARS: στρατηγικές για τον έλεγχο των αναδυόμενων κοροναϊών. Νατ. Rev. Microbiol. 11 , 836-848 (2013).
- Graham, RL & Baric, RS ανασυνδυασμός, δεξαμενές και η αρθρωτή ακίδα: μηχανισμοί μετάδοσης διαφόρων ειδών κοραναϊού J. Virol. 84 , 3134-3146 (2010).
- Agnihothram, S. et αϊ. Ένα μοντέλο ποντικιού για την υποομάδα betacoronavirus 2c χρησιμοποιώντας μια παραλλαγή στελέχους bat coronavirus HKU5. MBio 5 , e00047-14 (2014).
- Relman, DA Metagenomics, διαγνωστικά λοιμωδών νόσων και έρευνες εστιών: ακολουθήστε πρώτα, κάντε ερωτήσεις αργότερα; Μαρμελάδα. Med. Ανάδοχος 309 , 1531–1532 (2013).
- Ο Kaiser, J. Moratorium σχετικά με τις επικίνδυνες ιολογικές μελέτες αφήνει τη δουλειά του σε 14 ιδρύματα. ScienceInsider http://news.sciencemag.org/biology/2014/11/moratorium-risky-virology-studies-leaves-work-14-institutions-limbo (2014).
Frieman, Μ. Et αϊ. Μοριακοί προσδιοριστές του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου παθογένεσης κοροναϊού και μολυσματικότητας σε νεαρά και ηλικιωμένα μοντέλα ποντικών ανθρώπινης νόσου J. Virol. 86 , 884–897 (2012).
Ren, W. et αϊ. Διαφορά στη χρήση των υποδοχέων μεταξύ του κορανοϊού σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) και του κοροναϊού που μοιάζει με SARS προέλευσης νυχτερίδας. J. Virol. 82 , 1899–1907 (2008).
Sims, AC et al. Η απελευθέρωση σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου πυρηνικής εισαγωγής κορανοϊού ενισχύει τη μεταγραφή ξενιστή σε ανθρώπινα πνευμονικά κύτταρα. J. Virol. 87 , 3885–3902 (2013).
Fulcher, ML, Gabriel, S., Burns, KA, Yankaskas, JR & Randell, SH Καλά-διαφοροποιημένες καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινων αεραγωγών. Μέθοδοι ΜοΙ. Med. 107 , 183–206 (2005).
- Roberts, A. et al. Ένας προσαρμοσμένος σε ποντίκι SARS-κοροναϊός προκαλεί ασθένεια και θνησιμότητα σε ποντίκια BALB / c. PLoS Pathog. 3 , ε5.
Ευχαριστίες
Η έρευνα σε αυτό το χειρόγραφο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργίας και Λοιμωδών Νόσων και το Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας των ΗΠΑ (NIH) με τα βραβεία U19AI109761 (RSB), U19AI107810 (RSB), AI085524 (WAM), F32AI102561 (VDM) και K99AG049092 (VDM), και από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικής Επιστήμης της Κίνας βραβεία 81290341 (Z.-LS) και 31470260 (X.-YG), και από τη χρηματοδότηση USAID-EPT-PREDICT από την EcoHealth Alliance (Z. -LS). Οι επιθηλιακές καλλιέργειες των ανθρώπινων αεραγωγών υποστηρίχθηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Διαβήτη και Πεπτικού και Νεφρικής Νόσου του ΝΙΗ με το βραβείο NIH DK065988 (SHR). Ευχαριστούμε επίσης τον MT Ferris (Τμήμα Γενετικής, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας) για την αναθεώρηση των στατιστικών προσεγγίσεων και του CT Tseng (Τμήμα Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας, Ιατρικό υποκατάστημα του Πανεπιστημίου του Τέξας) για την παροχή κυττάρων Calu-3. Τα πειράματα με τους πλήρους μήκους και χιμαιρικούς ανασυνδυασμένους ιούς SHC014 ξεκίνησαν και πραγματοποιήθηκαν πριν από την παύση χρηματοδότησης της έρευνας GOF και έκτοτε έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί για συνεχιζόμενη μελέτη από το NIH. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστικά ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύει απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του NIH.
Πληροφορίες συγγραφέα
Συνεργασίες
- Τμήμα Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας, το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill, Chapel Hill, Βόρεια Καρολίνα, ΗΠΑ
- Kari Debbink
- & Ralph S Baric
- Βασικό εργαστήριο ειδικών παθογόνων και βιοασφάλειας, Ινστιτούτο ιολογίας Wuhan, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Γουχάν, Κίνα
- Xing-Yi Ge
- & Ζενγκλί-Λι Σι
- Τμήμα Κυτταρικής Βιολογίας και Φυσιολογίας, το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill, Chapel Hill, Βόρεια Καρολίνα, ΗΠΑ
- Σκοτ Χ Ράντελ
- Cystic Fibrosis Center, Marsico Lung Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, Βόρεια Καρολίνα, ΗΠΑ
- Σκοτ Χ Ράντελ
- Ινστιτούτο Έρευνας στη Βιοϊατρική, Bellinzona Institute of Microbiology, Ζυρίχη, Ελβετία
- Αντόνιο Λανζαβέκια
- Τμήμα Ανοσολογίας Καρκίνου και AIDS, Ινστιτούτο Καρκίνου Dana-Farber, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Βοστώνη, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ
- Wayne A Marasco
- Τμήμα Ιατρικής, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Βοστώνη, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ
- Wayne A Marasco
Συνεισφορές
Ο VDM σχεδίασε, συντονίζει και πραγματοποίησε πειράματα, ολοκλήρωσε την ανάλυση και έγραψε το χειρόγραφο. Η BLY σχεδίασε τον μολυσματικό κλώνο και ανέκτησε χιμαιρικούς ιούς. Η SA ολοκλήρωσε τους προσδιορισμούς εξουδετέρωσης. Το LEG βοήθησε στην εκτέλεση πειραμάτων ποντικιού. Οι TS και JAP ολοκλήρωσαν πειράματα ποντικιών και δοκιμασίες πλάκας. Το X.-YG πραγματοποίησε πειράματα ψευδοτύπου. Η KD δημιούργησε δομικά στοιχεία και προβλέψεις. Η EFD δημιούργησε φυλογενετική ανάλυση. Η RLG ολοκλήρωσε την ανάλυση RNA. Η SHR παρείχε πρωτογενείς καλλιέργειες HAE. Τα AL και WAM παρείχαν κρίσιμα αντιδραστήρια μονοκλωνικών αντισωμάτων. και Z.-LS παρείχαν SHC014 ακίδες αλληλουχίες και πλασμίδια. Η RSB σχεδίασε πειράματα και έγραψε το χειρόγραφο.
Αντίστοιχοι συγγραφείς
Αλληλογραφία με το Vineet D Menachery ή το Ralph S Baric.
Δηλώσεις δεοντολογίας
Ανταγωνιστικά ενδιαφέροντα
Οι δημιουργοί ανακοίνωσαν μη ανταγωνιζόμενα οικονομικά συμφέροντα.
Συμπληρωματικό κείμενο και αριθμοί
Συμπληρωματικά Σχήματα 1–6 και Συμπληρωματικοί Πίνακες 1–4 (PDF 4747 kb)
Εκτυπώσεις και δικαιώματα
Αναφέρετε αυτό το άρθρο
Menachery, V., Yount, B., Debbink, K. et al. Ένα σύμπλεγμα που μοιάζει με SARS των κοροναϊών νυχτερίδας που κυκλοφορεί δείχνει δυνατότητες για ανθρώπινη εμφάνιση. Nat Med 21, 1508–1513 (2015). https://doi.org/10.1038/nm.3985
- Λήφθηκε
- Αποδεκτό
- Δημοσίευσε
- Ημερομηνία έκδοσης
Πηγή: Δωρεάν λήψη MP3 από ΕΞΩ ΕΛΕΓΧΟΥ στο SoundCloud.com
Για να μοιραστείτε αυτό το άρθρο στο FACEBOOK, ΠΑΡΑΚΑΛΩ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣΤΕ και ΠΑΡΕΤΕ αυτόν τον σύνδεσμο: https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/
Πηγές:
- Ένα σύμπλεγμα SARS που μοιάζει με κοροναϊούς νυχτερίδας που κυκλοφορεί δείχνει δυνατότητες για ανθρώπινη εμφάνιση
- Απομόνωση και χαρακτηρισμός ενός κοροναϊού τύπου SAR με ρόπαλο που χρησιμοποιεί τον υποδοχέα ACE2
- Σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο
- Αντιστροφή προχωρημένης νόσου του ιού Έμπολα σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου με ZMapp
- Μια δεκαετία μετά το SARS: στρατηγικές για τον έλεγχο των αναδυόμενων κοροναϊών
Ο Duff έχει ταξιδέψει εκτενώς, δημοσιεύεται σε όλο τον κόσμο και είναι τακτικός επισκέπτης στην τηλεόραση και το ραδιόφωνο σε περισσότερες από «πολλές» χώρες. Είναι επίσης εκπαιδευμένος σεφ, λάτρεις του κρασιού, άπληστος μοτοσυκλετιστής και όπλο που ειδικεύεται στα ιστορικά όπλα και την αποκατάσταση. Η επιχειρηματική εμπειρία και τα ενδιαφέροντα αφορούν την τεχνολογία ενέργειας και άμυνας.
Αρχεία του Γκόρντον - 2008-2014
Λόγω της φύσης του ανεξάρτητου περιεχομένου, η VT δεν μπορεί να εγγυηθεί την εγκυρότητα του περιεχομένου.
Σας ζητάμε να διαβάσετε την Πολιτική Περιεχομένου μας, έτσι ώστε μια σαφής κατανόηση των ανεξάρτητων μέσων χωρίς λογοκρισία της VT να γίνει κατανοητή και να δοθεί η κατάλληλη θέση στον κόσμο των ειδήσεων, της γνώμης και των μέσων ενημέρωσης.
Όλο το περιεχόμενο ανήκει αποκλειστικά στον συγγραφέα. Οι εκφρασμένες απόψεις ΔΕΝ είναι απαραίτητα οι απόψεις του VT, άλλων συγγραφέων, συνεργατών, διαφημιστών, χορηγών, συνεργατών ή τεχνικών. Κάποιο περιεχόμενο μπορεί να έχει σατιρικό χαρακτήρα. Όλες οι εικόνες είναι πλήρη ευθύνη του συγγραφέα και ΟΧΙ VT.
Σχετικά με την VT - Διαβάστε την Πλήρης ειδοποίηση πολιτικής - Πολιτική σχολίων
Documentary Proof: University of North Carolina Generated COVID-19
Research to create COVID 19 began in the United States in 2006 and culminated in a successful bio-weapon in 2015, with work done at the University of North Carolina and at Harvard and at the Food and Drug Administration’s lab in Arkansas. Proof Provided
This article contains hard proof that cannot be questioned or denied, which you may submit to any government agency or healthcare professional.
What is not yet proven but coming into focus is that the US biological weapons program at Fort Detrick, Maryland, equipment and certainly key staff, certainly migrated to secret labs at large state universities in order to “hide in plain sight.”
Follow the careers, all links are included, of those who worked on the Wuhan-COVID project in 2017.
Also, note that the exact same personnel and equipment are used for fake “prevention” research and testing as weaponization and actual production.
Since this article was written, we have begun to look at worldwide operations of US nuclear/bio/chem contractor, Kushner-Trump favorite, Battelle, and their secret labs around the world.
When we began, our people started to be threatened. That was a serious mistake.
Submit this paper to any physician, or other qualified bio-sciences specialists. See what they say.
Introduction
Documents below will show that research to create COVID 19 began in the United States in 2006 and culminated in a successful bio-weapon in 2015, with work done at the University of North Carolina and at Harvard and at the Food and Drug Administration’s lab in Arkansas.
Their work was titled:
A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
They did this and more, so much more as you will read below.
As Trump said, over and over and over, the Chinese were involved.
Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China supplied the Wuhan Bat Virus which was used in the American study. Their name was included for that reason only.
COVID 19 was a US Army bio-weapons project to manufacture a pneumonia-causing disease that would be nearly impossible to vaccinate for inpatients over 40 years old.
For the proof, click here
Gordon Duff is a Marine combat veteran of the Vietnam War. He is a disabled veteran and has worked on veterans and POW issues for decades. Gordon is an accredited diplomat and is generally accepted as one of the top global intelligence specialists. He manages the world’s largest private intelligence organization and regularly consults with governments challenged by security issues.
Duff has traveled extensively, is published around the world and is a regular guest on TV and radio in more than “several” countries. He is also a trained chef, wine enthusiast, avid motorcyclist and gunsmith specializing in historical weapons and restoration. Business experience and interests are in energy and defense technology.
Gordon’s Archives – 2008-2014
Banned: COVID began in North Carolina, not Wuhan, not until 2 years later
VT had the story right from the beginning. Now that the CIA is officially tasked with finding a source for COVID, someone to blame, the vast American program of bio-warfare defense which creates every nasty virus we have seen, probably ebola, certainly swine flu, and then “accidentally” releases them in such a way that the CIA’s agenda is served.
Since this article was written, we have begun to look at worldwide operations of US nuclear/bio/chem contractor, Kushner-Trump’s favorite, Battelle, and their secret labs around the world.
When we began, our people started to be threatened. That was a serious mistake.
Submit this paper to any physician or other qualified bio-sciences specialist. See what they say.
TO SHARE THIS ARTICLE ON FACEBOOK, PLEASE COPY and PASTE this link: https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/
Introduction
Documents below will show that research to create COVID 19 began in the United States in 2006 and culminated in a successful bio-weapon in 2015, with work done at the University of North Carolina and at Harvard and at the Food and Drug Administration’s lab in Arkansas.
Their work was titled:
A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
They did this and more, so much more as you will read below.
As Trump said, over and over and over, the Chinese were involved.
Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China supplied the Wuhan Bat Virus which was used in the American study. Their name was included for that reason only.
COVID 19 was a US Army bio-weapons project to manufacture a pneumonia-causing disease that would be nearly impossible to vaccinate for in patients over 40 years old.
The proof is here, simply scroll down. The study was run by the University of North Carolina and funded by USAID/CIA. It chose a Chinese bat virus and chose to include a medical facility in Wuhan as well.
Now we know why, a smokescreen of the blame for a program China had little or nothing to do with, something satanically evil and purely American.
In November 2015, a study was published outlining the capability of producing the virus we are dealing with now. Among the many involved was a lab in Wuhan, China. It was listed from the beginning as one of the dozens, mostly American, working on this project.
However, one key participant was left out, USAID. It is suspected, deeply so, that USAID is a front for American bio-warfare research such as that done in Tbilisi, Georgia, and elsewhere, much documented. This is the citation that adds USAID to the research funding group.
Change history
20 November 2015
In the version of this article initially published online, the authors omitted to acknowledge a funding source, USAID-EPT-PREDICT funding from EcoHealth Alliance, to Z.-L.S. The error has been corrected for the print, PDF and HTML versions of this article.
[ Editor’s Note: We will now present Pravda’s biased article and, below that, the actual study proving the capability of producing COVID 19, proving it is not a naturally occurring virus once and for all.
As to who did what, this is not our job but we are proving, categorically, that when a Chinese lab is mentioned, it is a minor player in an American effort, as outlined exhaustively below.
This makes discussing the Wuhan lab possibly complicit in bio-warfare.
Similarly, when Forbes Magazine and others stated they could prove COVID 19 was made naturally, and of course they had the same access we have, we suspect that they are part of a disinformation effort tied to USAID and bio-warfare.
Suspicion is not proof. The proof is proof and there is proof enough to drown in. Our thanks to the American medical professionals who pimped themselves out to the US Army and CIA and who helped bring us where we are now, a nation broken to pieces…VeteransToday ]
Pravda.Ru: Such material appeared in 2015 on the website of the scientific journal Natura in 2015. Then the authors claimed that after the advent of the SARS virus (2002-2003) and the Middle East respiratory syndrome (MERS), scientists were aware of the risk of interspecific transmission that would lead to an epidemic among people.
Successful lab experiment
Among other things, the research team studied bats, which are the largest incubators of coronaviruses. Nevertheless, bats could not transmit the coronavirus to humans because they could not interact with human cells with ACE2 receptors.
The material also stated that horseshoe bats carry a strain of SARS coronavirus that can be transmitted to humans. It has been named the SHC014-CoV virus.
To better study this virus, scientists copied the coronavirus and infected it with laboratory mice. The results showed that the virus is really able to bind to human cells with ACE2 receptors and multiply in the cells of the respiratory system.
In the research work, it is noted that laboratory materials, samples and equipment that were used in the research were obtained from the Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Although it is not yet possible to say for sure that the virus that was tested in laboratory mice is the same as the SARS-Cove-2 coronavirus.
NATO policy
However, interesting things can be found in earlier documents.
For example:
- The 2019 Alliance’s activity report says that in 2019, the Alliance’s first place in research and development was occupied by the topic of radiochemical and biological protection (29%), shifting the seemingly most pressing problem of Europe – counterterrorism (it turned out to be 4- m priority).
- A year earlier, in 2018, the situation was exactly the opposite: terrorism, as it should be, was in the first place (28%), and radiochemical and biological protection in the fourth (13%).
As the Brussels snitch writes in the telegram channel, “given the absence of visible reasons for such a sharp change in scientific interests, there are two options and both are unpleasant:
- or NATO now wags the fifth point, falsifying the data to show “and we always prepared for viruses, we are modern”,
- or even in 2019 in the alliance, God forgive me, they knew where the trouble would come from.
Yes, the first option is much more real, but, you see, the facts are surprising.
Source: Pravda
Original 2015 Research Unedited and Complete
Published: A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence by Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric
Nature Medicine volume 21, pages 1508–1513 (2015)
A Corrigendum to this article was published on 06 April 2016
This article has been updated
Abstract
The emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and the Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV underscores the threat of cross-species transmission events leading to outbreaks in humans. Here we examine the disease potential of a SARS-like virus, SHC014-CoV, which is currently circulating in Chinese horseshoe bat populations1. Using the SARS-CoV reverse genetics system2, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone.
The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin-converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis.
Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approach failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein.
On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo. Our work suggests a potential risk of SARS-CoV re-emergence from viruses currently circulating in bat populations.
Main
The emergence of SARS-CoV heralded a new era in the cross-species transmission of severe respiratory illness with globalization leading to rapid spread around the world and massive economic impact3,4. Since then, several strains—including influenza A strains H5N1, H1N1 and H7N9, and MERS-CoV—have emerged from animal populations, causing considerable disease, mortality and economic hardship for the afflicted regions5. Although public health measures were able to stop the SARS-CoV outbreak4, recent metagenomics studies have identified sequences of closely related SARS-like viruses circulating in Chinese bat populations that may pose a future threat1,6.
However, sequence data alone provides minimal insights to identify and prepare for future pre-pandemic viruses. Therefore, to examine the emergence potential (that is, the potential to infect humans) of circulating bat CoVs, we built a chimeric virus encoding a novel, zoonotic CoV spike protein—from the RsSHC014-CoV sequence that was isolated from Chinese horseshoe bats1—in the context of the SARS-CoV mouse-adapted backbone. The hybrid virus allowed us to evaluate the ability of the novel spike protein to cause disease independently of other necessary adaptive mutations in its natural backbone.
Using this approach, we characterized CoV infection mediated by the SHC014 spike protein in primary human airway cells and in vivo and tested the efficacy of available immune therapeutics against SHC014-CoV. Together, the strategy translates metagenomics data to help predict and prepare for future emergent viruses.
The sequences of SHC014 and the related RsWIV1-CoV show that these CoVs are the closest relatives to the epidemic SARS-CoV strains (Fig. 1a,b); however, there are important differences in the 14 residues that bind human ACE2, the receptor for SARS-CoV, including the five that are critical for host range: Y442, L472, N479, T487 and Y491 (ref. 7).
In WIV1, three of these residues vary from the epidemic SARS-CoV Urbani strain, but they were not expected to alter binding to ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). This fact is confirmed by both pseudotyping experiments that measured the ability of lentiviruses encoding WIV1 spike proteins to enter cells expressing human ACE2 (Supplementary Fig. 1) and by in vitro replication assays of WIV1-CoV (ref. 1). In contrast, 7 of 14 ACE2-interaction residues in SHC014 are different from those in SARS-CoV, including all five residues critical for host range (Supplementary Fig. 1c and Supplementary Table 1).
These changes, coupled with the failure of pseudotyped lentiviruses expressing the SHC014 spike to enter cells (Supplementary Fig. 1d), suggested that the SHC014 spike is unable to bind human ACE2. However, similar changes in related SARS-CoV strains had been reported to allow ACE2 binding7,8, suggesting that additional functional testing was required for verification.
Therefore, we synthesized the SHC014 spike in the context of the replication-competent, mouse-adapted SARS-CoV backbone (we hereafter refer to the chimeric CoV as SHC014-MA15) to maximize the opportunity for pathogenesis and vaccine studies in mice (Supplementary Fig. 2a). Despite predictions from both structure-based modeling and pseudotyping experiments, SHC014-MA15 was viable and replicated to high titers in Vero cells (Supplementary Fig. 2b). Similar to SARS, SHC014-MA15 also required a functional ACE2 molecule for entry and could use human, civet and bat ACE2 orthologs (Supplementary Fig. 2c,d).
To test the ability of the SHC014 spike to mediate infection of the human airway, we examined the sensitivity of the human epithelial airway cell line Calu-3 2B4 (ref. 9) to infection and found robust SHC014-MA15 replication, comparable to that of SARS-CoV Urbani (Fig. 1c).
To extend these findings, primary human airway epithelial (HAE) cultures were infected and showed robust replication of both viruses (Fig. 1d). Together, the data confirm the ability of viruses with the SHC014 spike to infect human airway cells and underscore the potential threat of cross-species transmission of SHC014-CoV.
Figure 1: SARS-like viruses replicate in human airway cells and produce in vivo pathogenesis.
(a) The full-length genome sequences of representative CoVs were aligned and phylogenetically mapped as described in the Online Methods. The scale bar represents nucleotide substitutions, with only bootstrap support above 70% being labeled. The tree shows CoVs divided into three distinct phylogenetic groups, defined as α-CoVs, β-CoVs and γ-CoVs. Classical subgroup clusters are marked as 2a, 2b, 2c and 2d for the β-CoVs and as 1a and 1b for the α-CoVs. (b) Amino acid sequences of the S1 domains of the spikes of representative β-CoVs of the 2b group, including SARS-CoV, were aligned and phylogenetically mapped. The scale bar represents the amino acid substitutions. (c,d) Viral replication of SARS-CoV Urbani (black) and SHC014-MA15 (green) after infection of Calu-3 2B4 cells (c) or well-differentiated, primary air-liquid interface HAE cell cultures (d) at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01 for both cell types. Samples were collected at individual time points with biological replicates (n = 3) for both Calu-3 and HAE experiments. (e,f) Weight loss (n = 9 for SARS-CoV MA15; n = 16 for SHC014-MA15) (e) and viral replication in the lungs (n = 3 for SARS-CoV MA15; n = 4 for SHC014-MA15) (f) of 10-week-old BALB/c mice infected with 1 × 104 p.f.u. of mouse-adapted SARS-CoV MA15 (black) or SHC014-MA15 (green) via the intranasal (i.n.) route. (g,h) Representative images of lung sections stained for SARS-CoV N antigen from mice infected with SARS-CoV MA15 (n = 3 mice) (g) or SHC014-MA15 (n = 4 mice) (h) are shown. For each graph, the center value represents the group mean, and the error bars define the s.e.m. Scale bars, 1 mm.
Full size image
To evaluate the role of the SHC014 spike in mediating infection in vivo, we infected 10-week-old BALB/c mice with 104 plaque-forming units (p.f.u.) of either SARS-MA15 or SHC014-MA15 (Fig. 1e–h). Animals infected with SARS-MA15 experienced rapid weight loss and lethality by 4 d post-infection (d.p.i.); in contrast, SHC014-MA15 infection produced substantial weight loss (10%) but no lethality in mice (Fig. 1e). Examination of viral replication revealed nearly equivalent viral titers from the lungs of mice infected with SARS-MA15 or SHC014-MA15 (Fig. 1f). Whereas lungs from the SARS-MA15–infected mice showed robust staining in both the terminal bronchioles and the lung parenchyma 2 d.p.i. (Fig. 1g), those of SHC014-MA15–infected mice showed reduced airway antigen staining (Fig. 1h); in contrast, no deficit in antigen staining was observed in the parenchyma or in the overall histology scoring, suggesting differential infection of lung tissue for SHC014-MA15 (Supplementary Table 2).
We next analyzed infection in more susceptible, aged (12-month-old) animals. SARS-MA15–infected animals rapidly lost weight and succumbed to infection (Supplementary Fig. 3a,b). SHC014-MA15 infection-induced robust and sustained weight loss, but had minimal lethality. Trends in the histology and antigen staining patterns that we observed in young mice were conserved in the older animals (Supplementary Table 3). We excluded the possibility that SHC014-MA15 was mediating infection through an alternative receptor on the basis of experiments using Ace2−/− mice, which did not show weight loss or antigen staining after SHC014-MA15 infection (Supplementary Fig. 4a,b and Supplementary Table 2). Together, the data indicate that viruses with the SHC014 spike are capable of inducing weight loss in mice in the context of a virulent CoV backbone.
Given the preclinical efficacy of Ebola monoclonal antibody therapies, such as ZMApp10, we next sought to determine the efficacy of SARS-CoV monoclonal antibodies against infection with SHC014-MA15. Four broadly neutralizing human monoclonal antibodies targeting SARS-CoV spike protein had been previously reported and are probable reagents for immunotherapy11,12,13. We examined the effect of these antibodies on viral replication (expressed as percentage inhibition of viral replication) and found that whereas wild-type SARS-CoV Urbani was strongly neutralized by all four antibodies at relatively low antibody concentrations (Fig. 2a–d), neutralization varied for SHC014-MA15. Fm6, an antibody generated by phage display and escape mutants11,12, achieved only background levels of inhibition of SHC014-MA15 replication (Fig. 2a). Similarly, antibodies 230.15 and 227.14, which were derived from memory B cells of SARS-CoV–infected patients13, also failed to block SHC014-MA15 replication (Fig. 2b,c). For all three antibodies, differences between the SARS and SHC014 spike amino acid sequences corresponded to direct or adjacent residue changes found in SARS-CoV escape mutants (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), which probably explains the absence of the antibodies’ neutralizing activity against SHC014. Finally, monoclonal antibody 109.8 was able to achieve 50% neutralization of SHC014-MA15, but only at high concentrations (10 μg/ml) (Fig. 2d). Together, the results demonstrate that broadly neutralizing antibodies against SARS-CoV may only have marginal efficacy against emergent SARS-like CoV strains such as SHC014.
Figure 2: SARS-CoV monoclonal antibodies have marginal efficacy against SARS-like CoVs.
(a–d) Neutralization assays evaluating efficacy (measured as a reduction in the number of plaques) of a panel of monoclonal antibodies, which were all originally generated against epidemic SARS-CoV, against infection of Vero cells with SARS-CoV Urbani (black) or SHC014-MA15 (green). The antibodies tested were fm6 (n = 3 for Urbani; n = 5 for SHC014-MA15)11,12 (a), 230.15 (n = 3 for Urbani; n = 2 for SHC014-MA15) (b), 227.15 (n = 3 for Urbani; n = 5 for SHC014-MA15) (c) and 109.8 (n = 3 for Urbani; n = 2 for SHC014-MA15)13 (d). Each data point represents the group mean and error bars define the s.e.m. Note that the error bars in SARS-CoV Urbani–infected Vero cells in b,c are overlapped by the symbols and are not visible.
Full size image
To evaluate the efficacy of existing vaccines against infection with SHC014-MA15, we vaccinated aged mice with double-inactivated whole SARS-CoV (DIV). Previous work showed that DIV could neutralize and protect young mice from challenge with a homologous virus14; however, the vaccine failed to protect aged animals in which augmented immune pathology was also observed, indicating the possibility of the animals being harmed because of the vaccination15. Here we found that DIV did not provide protection from challenge with SHC014-MA15 with regards to weight loss or viral titer (Supplementary Fig. 5a,b). Consistent with a previous report with other heterologous groups 2b CoVs15, serum from DIV-vaccinated, aged mice also failed to neutralize SHC014-MA15 (Supplementary Fig. 5c).
Notably, DIV vaccination resulted in robust immune pathology (Supplementary Table 4) and eosinophilia (Supplementary Fig. 5d–f). Together, these results confirm that the DIV vaccine would not be protective against infection with SHC014 and could possibly augment disease in the aged vaccinated group.
In contrast to the vaccination of mice with DIV, the use of SHC014-MA15 as a live, attenuated vaccine showed potential cross-protection against challenge with SARS-CoV, but the results have important caveats. We infected young mice with 104 p.f.u. of SHC014-MA15 and observed them for 28 d. We then challenged the mice with SARS-MA15 at day 29 (Supplementary Fig. 6a). The prior infection of the mice with the high dose of SHC014-MA15 conferred protection against challenge with a lethal dose of SARS-MA15, although there was only a minimal SARS-CoV neutralization response from the antisera elicited 28 d after SHC014-MA15 infection (Supplementary Fig. 6b, 1:200). In the absence of a secondary antigen boost, 28 d.p.i. represents the expected peak of antibody titers and implies that there will be diminished protection against SARS-CoV over time16,17. Similar results showing protection against challenge with a lethal dose of SARS-CoV were observed in aged BALB/c mice with respect to weight loss and viral replication (Supplementary Fig. 6c,d). However, the SHC014-MA15 infection dose of 104 p.f.u. induced >10% weight loss and lethality in some aged animals (Fig. 1 and Supplementary Fig. 3). We found that vaccination with a lower dose of SHC014-MA15 (100 p.f.u.), did not induce weight loss, but it also failed to protect aged animals from a SARS-MA15 lethal dose challenge (Supplementary Fig. 6e,f). Together, the data suggest that the SHC014-MA15 challenge may confer cross-protection against SARS-CoV through conserved epitopes, but the required dose induces pathogenesis and precludes use as an attenuated vaccine.
Having established that the SHC014 spike has the ability to mediate infection of human cells and cause disease in mice, we next synthesized a full-length SHC014-CoV infectious clone based on the approach used for SARS-CoV (Fig. 3a)2. Replication in Vero cells revealed no deficit for SHC014-CoV relative to that for SARS-CoV (Fig. 3b); however, SHC014-CoV was significantly (P < 0.01) attenuated in primary HAE cultures at both 24 and 48 h after infection (Fig. 3c). In vivo infection of mice demonstrated no significant weight loss but showed reduced viral replication in lungs of full-length SHC014-CoV infection, as compared to SARS-CoV Urbani (Fig. 3d,e). Together, the results establish the viability of full-length SHC014-CoV but suggest that further adaptation is required for its replication to be equivalent to that of epidemic SARS-CoV in human respiratory cells and in mice.
Figure 3: Full-length SHC014-CoV replicates in human airways but lacks the virulence of epidemic SARS-CoV.
(a) Schematic of the SHC014-CoV molecular clone, which was synthesized as six contiguous cDNAs (designated SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E and SHC014F) flanked by unique BglI sites that allowed for directed assembly of the full-length cDNA expressing open reading frames (for 1a, 1b, spike, 3, envelope, matrix, 6–8 and nucleocapsid). Underlined nucleotides represent the overhang sequences formed after restriction enzyme cleavage. (b,c) Viral replication of SARS-CoV Urbani (black) or SHC014-CoV (green) after infection of Vero cells (b) or well-differentiated, primary air-liquid interface HAE cell cultures (c) at an MOI of 0.01. Samples were collected at individual time points with biological replicates (n = 3) for each group. Data represent one experiment for both Vero and HAE cells. (d,e) Weight loss (n = 3 for SARS-CoV MA15, n = 7 for SHC014-CoV; n = 6 for SARS-Urbani) (d) and viral replication in the lungs (n = 3 for SARS-Urbani and SHC014-CoV) (e) of 10-week-old BALB/c mice infected with 1 × 105 p.f.u. of SARS-CoV MA15 (gray), SHC014-CoV (green) or SARS-CoV Urbani (black) via the i.n. route. Each data point represents the group mean, and error bars define the s.e.m. **P < 0.01 and ***P < 0.001 using two-tailed Student’s t-test of individual time points.
During the SARS-CoV epidemic, links were quickly established between palm civets and the CoV strains that were detected in humans4.
Building on this finding, the common emergence paradigm argues that epidemic SARS-CoV originated as a bat virus, jumped to civets, and incorporated changes within the receptor-binding domain (RBD) to improve binding to civet Ace2 (ref. 18).
Subsequent exposure to people in live-animal markets permitted human infection with the civet strain, which, in turn, adapted to become the epidemic strain (Fig. 4a).
However, phylogenetic analysis suggests that early human SARS strains appear more closely related to bat strains than to civet strains18.
Therefore, a second paradigm argues that direct bat-human transmission initiated SARS-CoV emergence and that palm civets served as a secondary host and reservoir for continued infection (Fig. 4b)19. For both paradigms, spike adaptation in a secondary host is seen as a necessity, with most mutations expected to occur within the RBD, thereby facilitating improved infection. Both theories imply that pools of bat CoVs are limited and that host-range mutations are both random and rare, reducing the likelihood of future emergence events in humans.
Figure 4: Emergence paradigms for coronaviruses.
Coronavirus strains are maintained in quasi-species pools circulating in bat populations. (a,b) Traditional SARS-CoV emergence theories posit that host-range mutants (red circle) represent random and rare occurrences that permit infection of alternative hosts. The secondary-host paradigm (a) argues that a nonhuman host is infected by a bat progenitor virus and, through adaptation, facilitates transmission to humans; subsequent replication in humans leads to the epidemic viral strain. The direct paradigm (b) suggests that transmission occurs between bats and humans without the requirement of an intermediate host; selection then occurs in the human population with closely related viruses replicating in a secondary host, permitting continued viral persistence and adaptation in both. (c) The data from chimeric SARS-like viruses argue that the quasi-species pools maintain multiple viruses capable of infecting human cells without the need for mutations (red circles). Although adaptations in secondary or human hosts may be required for epidemic emergence, if SHC014 spike–containing viruses recombined with virulent CoV backbones (circles with green outlines), then epidemic disease may be the result in humans. Existing data support elements of all three paradigms.
Full size image
Although our study does not invalidate the other emergence routes, it does argue for a third paradigm in which circulating bat CoV pools maintain ‘poised’ spike proteins that are capable of infecting humans without mutation or adaptation (Fig. 4c). This hypothesis is illustrated by the ability of a chimeric virus containing the SHC014 spike in a SARS-CoV backbone to cause robust infection in both human airway cultures and in mice without RBD adaptation.
Coupled with the observation of previously identified pathogenic CoV backbones3,20, our results suggest that the starting materials required for SARS-like emergent strains are currently circulating in animal reservoirs. Notably, although full-length SHC014-CoV probably requires additional backbone adaption to mediate human disease, the documented high-frequency recombination events in CoV families underscores the possibility of future emergence and the need for further preparation.
To date, genomics screens of animal populations have primarily been used to identify novel viruses in outbreak settings21. The approach here extends these data sets to examine questions of viral emergence and therapeutic efficacy. We consider viruses with the SHC014 spike a potential threat owing to their ability to replicate in primary human airway cultures, the best available model for human disease. In addition, the observed pathogenesis in mice indicates a capacity for SHC014-containing viruses to cause disease in mammalian models, without RBD adaptation.
Notably, differential tropism in the lung as compared to that with SARS-MA15 and attenuation of full-length SHC014-CoV in HAE cultures relative to SARS-CoV Urbani suggest that factors beyond ACE2 binding—including spike processivity, receptor bio-availability or antagonism of the host immune responses—may contribute to the emergence. However, further testing in nonhuman primates is required to translate these findings into the pathogenic potential in humans.
Importantly, the failure of available therapeutics defines a critical need for further study and for the development of treatments. With this knowledge, surveillance programs, diagnostic reagents, and effective treatments can be produced that are protective against the emergence of group 2b–specific CoVs, such as SHC014, and these can be applied to other CoV branches that maintain similarly heterogeneous pools.
In addition to offering preparation against future emerging viruses, this approach must be considered in the context of the US government-mandated pause on gain-of-function (GOF) studies22.
On the basis of previous models of emergence (Fig. 4a,b), the creation of chimeric viruses such as SHC014-MA15 was not expected to increase pathogenicity. Although SHC014-MA15 is attenuated relative to its parental mouse-adapted SARS-CoV, similar studies examining the pathogenicity of CoVs with the wild-type Urbani spike within the MA15 backbone showed no weight loss in mice and reduced viral replication23. Thus, relative to the Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 shows again in pathogenesis (Fig. 1).
On the basis of these findings, scientific review panels may deem similar studies building chimeric viruses based on circulating strains too risky to pursue, as increased pathogenicity in mammalian models cannot be excluded.
Coupled with restrictions on mouse-adapted strains and the development of monoclonal antibodies using escape mutants, research into CoV emergence and therapeutic efficacy may be severely limited moving forward. Together, these data and restrictions represent a crossroads of GOF research concerns; the potential to prepare for and mitigate future outbreaks must be weighed against the risk of creating more dangerous pathogens. In developing policies moving forward, it is important to consider the value of the data generated by these studies and whether these types of chimeric virus studies warrant further investigation versus the inherent risks involved.
Overall, our approach has used metagenomics data to identify a potential threat posed by the circulating bat SARS-like CoV SHC014. Because of the ability of chimeric SHC014 viruses to replicate in human airway cultures, cause pathogenesis in vivo and escape current therapeutics, there is a need for both surveillance and improved therapeutics against circulating SARS-like viruses. Our approach also unlocks the use of metagenomics data to predict viral emergence and to apply this knowledge in preparing to treat future emerging virus infections.
Methods
Viruses, cells, in vitro infection and plaque assays
Wild-type SARS-CoV (Urbani), mouse-adapted SARS-CoV (MA15) and chimeric SARS-like CoVs were cultured on Vero E6 cells (obtained from United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases), grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Gibco, CA) and 5% fetal clone serum (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) along with antibiotic/antimycotic (Gibco, Carlsbad, CA). DBT cells (Baric laboratory, source unknown) expressing ACE2 orthologs have been previously described for both human and civet; bat Ace2 sequence was based on that from Rhinolophus leschenaulti, and DBT cells expressing bat Ace2 were established as described previously8.
Pseudotyping experiments were similar to those using an HIV-based pseudovirus, prepared as previously described10, and examined on HeLa cells (Wuhan Institute of Virology) that expressed ACE2 orthologs. HeLa cells were grown in minimal essential medium (MEM) (Gibco, CA) supplemented with 10% FCS (Gibco, CA) as previously described24.
Growth curves in Vero E6, DBT, Calu-3 2B4, and primary human airway epithelial cells were performed as previously described8,25. None of the working cell line stocks were authenticated or tested for mycoplasma recently, although the original seed stocks used to create the working stocks are free from contamination. Human lungs for HAE cultures were procured under the University of North Carolina at Chapel Hill Institutional Review Board–approved protocols. HAE cultures represent highly differentiated human airway epithelium containing ciliated and non-ciliated epithelial cells as well as goblet cells. The cultures are also grown on an air-liquid interface for several weeks before use, as previously described26.
Briefly, cells were washed with PBS and inoculated with the virus or mock-diluted in PBS for 40 min at 37 °C. After inoculation, cells were washed three times and a fresh medium was added to signify time ‘0’. Three or more biological replicates were harvested at each described time point. No blinding was used in any sample collections nor was samples randomized. All virus cultivation was performed in a biosafety level (BSL) 3 laboratory with redundant fans in the biosafety cabinets, as described previously by our group2. All personnel wore powered air-purifying respirators (Breathe Easy, 3M) with Tyvek suits, aprons, and booties and were double-gloved.
Sequence clustering and structural modeling.
The full-length genomic sequences and the amino acid sequences of the S1 domains of the spike of representative CoVs were downloaded from Genbank or Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), aligned with ClustalX and phylogenetically compared by using maximum likelihood estimation using 100 bootstraps or by using the PhyML package, respectively. The tree was generated using maximum likelihood with the PhyML package. The scale bar represents nucleotide substitutions. Only nodes with bootstrap support above 70% are labeled.
The tree shows that CoVs are divided into three distinct phylogenetic groups defined as α-CoVs, β-CoVs, and γ-CoVs. Classical subgroup clusters are marked as 2a, 2b, 2c, and 2d for β-CoVs, and 1a and 1b for the α-CoVs. Structural models were generated using Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) to generate homology models for SHC014 and Rs3367 of the SARS RBD in complex with ACE2 based on crystal structure 2AJF (Protein Data Bank). Homology models were visualized and manipulated in MacPyMol (version 1.3).
Construction of SARS-like chimeric viruses.
Both wild-type and chimeric viruses were derived from either SARS-CoV Urbani or the corresponding mouse-adapted (SARS-CoV MA15) infectious clone (ic) as previously described27.
Plasmids containing spike sequences for SHC014 were extracted by restriction digest and ligated into the E and F plasmid of the MA15 infectious clone. The clone was designed and purchased from Bio Basic as six contiguous cDNAs using published sequences flanked by unique class II restriction endonuclease sites (BglI). Thereafter, plasmids containing wild-type, chimeric SARS-CoV, and SHC014-CoV genome fragments were amplified, excised, ligated, and purified.
In vitro transcription reactions were then performed to synthesize full-length genomic RNA, which was transfected into Vero E6 cells as previously described2. The medium from transfected cells was harvested and served as seed stocks for subsequent experiments. Chimeric and full-length viruses were confirmed by sequence analysis before use in these studies. Synthetic construction of chimeric mutant and full-length SHC014-CoV was approved by the University of North Carolina Institutional Biosafety Committee and the Dual Use Research of Concern committee.
Ethics statement
This study was carried out in accordance with the recommendations for the care and use of animals by the Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH. The Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of The University of North Carolina at Chapel Hill (UNC, Permit Number A-3410-01) approved the animal study protocol (IACUC #13-033) used in these studies.
Mice and in vivo infection
Female, 10-week-old, and 12-month-old BALB/cAnNHsD mice were ordered from Harlan Laboratories. Mouse infections were done as previously described20. Briefly, animals were brought into a BSL3 laboratory and allowed to acclimate for 1 week before infection. For infection and live-attenuated virus vaccination, mice were anesthetized with a mixture of ketamine and xylazine and infected intranasally, when challenged, with 50 μl of phosphate-buffered saline (PBS) or diluted virus with three or four mice per time point, per infection group per dose as described in the figure legends.
For individual mice, notations for infection including failure to inhale the entire dose, bubbling of inoculum from the nose, or infection through the mouth may have led to exclusion of mouse data at the discretion of the researcher; post-infection, no other pre-established exclusion or inclusion criteria are defined. No blinding was used in any animal experiments, and animals were not randomized. For vaccination, young and aged mice were vaccinated by footpad injection with a 20-μl volume of either 0.2 μg of double-inactivated SARS-CoV vaccine with alum or mock PBS; mice were then boosted with the same regimen 22 d later and challenged 21 d thereafter.
For all groups, as per protocol, animals were monitored daily for clinical signs of disease (hunching, ruffled fur, and reduced activity) for the duration of the experiment. Weight loss was monitored daily for the first 7 d, after which weight monitoring continued until the animals recovered to their initial starting weight or displayed weight gain continuously for 3 d.
All mice that lost greater than 20% of their starting body weight were ground-fed and further monitored multiple times per day as long as they were under the 20% cutoff. Mice that lost greater than 30% of their starting body weight were immediately sacrificed as per protocol. Any mouse deemed to be moribund or unlikely to recover was also humanely sacrificed at the discretion of the researcher. Euthanasia was performed using an isoflurane overdose and death was confirmed by cervical dislocation. All mouse studies were performed at the University of North Carolina (Animal Welfare Assurance #A3410-01) using protocols approved by the UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Histological analysis.
The left lung was removed and submerged in 10% buffered formalin (Fisher) without inflation for 1 week. Tissues were embedded in paraffin and 5-μm sections were prepared by the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center histopathology core facility. To determine the extent of antigen staining, sections were stained for viral antigen using a commercially available polyclonal SARS-CoV anti-nucleocapsid antibody (Imgenex) and scored in a blinded manner by for staining of the airway and parenchyma as previously described20. Images were captured using an Olympus BX41 microscope with an Olympus DP71 camera.
Virus neutralization assays.
Plaque reduction neutralization titer assays were performed with previously characterized antibodies against SARS-CoV, as previously described11,
12,13
. Briefly, neutralizing antibodies or serum was serially diluted twofold and incubated with 100 p.f.u. of the different infectious clone, SARS-CoV strains for 1 h at 37 °C. The virus and antibodies were then added to a 6-well plate with 5 × 105 Vero E6 cells/well with multiple replicates (n ≥ 2). After a 1-h incubation at 37 °C, cells were overlaid with 3 ml of 0.8% agarose in a medium. Plates were incubated for 2 d at 37 °C, stained with neutral red for 3 h, and plaques were counted. The percentage of plaque reduction was calculated as (1 − (no. of plaques with an antibody/no. of plaques without antibody)) × 100.
Statistical analysis
All experiments were conducted contrasting two experimental groups (either two viruses, or vaccinated and unvaccinated cohorts). Therefore, significant differences in viral titer and histology scoring were determined by a two-tailed Student’s t-test at individual time points. Data were normally distributed in each group being compared and had similar variance.
Biosafety and biosecurity
Reported studies were initiated after the University of North Carolina Institutional Biosafety Committee approved the experimental protocol (Project Title: Generating infectious clones of bat SARS-like CoVs; Lab Safety Plan ID: 20145741; Schedule G ID: 12279).
These studies were initiated before the US Government Deliberative Process Research Funding Pause on Selected Gain-of-Function Research Involving Influenza, MERS, and SARS Viruses. This paper has been reviewed by the funding agency, the NIH. Continuation of these studies was requested, and this has been approved by the NIH.
SARS-CoV is a select agent. All work for these studies was performed with approved standard operating procedures (SOPs) and safety conditions for SARS-CoV, MERs-CoV, and other related CoVs. Our institutional CoV BSL3 facilities have been designed to conform to the safety requirements that are recommended in the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), the US Department of Health and Human Services, the Public Health Service, the Centers for Disease Control (CDC) and the NIH. Laboratory safety plans were submitted to, and the facility has been approved for use by, the UNC Department of Environmental Health and Safety (EHS) and the CDC. Electronic card access is required for entry into the facility.
All workers have been trained by EHS to safely use powered air-purifying respirators (PAPRs), and appropriate work habits in a BSL3 facility and active medical surveillance plans are in place. Our CoV BSL3 facilities contain redundant fans, emergency power to fans and biological safety cabinets and freezers, and our facilities can accommodate SealSafe mouse racks. Materials classified as BSL3 agents consist of SARS-CoV, bat CoV precursor strains, MERS-CoV and mutants derived from these pathogens. Within the BSL3 facilities, experimentation with an infectious virus is performed in a certified Class II Biosafety Cabinet (BSC).
All members of the staff wear scrubs, Tyvek suits and aprons, PAPRs and shoe covers, and their hands are double-gloved. BSL3 users are subject to a medical surveillance plan monitored by the University Employee Occupational Health Clinic (UEOHC), which includes a yearly physical, annual influenza vaccination and mandatory reporting of any symptoms associated with CoV infection during periods when working in the BSL3. All BSL3 users are trained in exposure management and reporting protocols, are prepared to self-quarantine and have been trained for safe delivery to a local infectious disease management department in an emergency situation. All potential exposure events are reported and investigated by EHS and UEOHC, with reports filed to both the CDC and the NIH.
Accession codes
Accessions
Protein Data Bank
- 2AJF
Change history
20 November 2015
In the version of this article initially published online, the authors omitted to acknowledge a funding source, USAID-EPT-PREDICT funding from EcoHealth Alliance, to Z.-L.S. The error has been corrected for the print, PDF and HTML versions of this article.
References
- Ge, X.Y. et al. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535–538 (2013).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Yount, B. et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12995–13000 (2003).
Becker, M.M. et al. Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 19944–19949 (2008).
- Peiris, J.S., Guan, Y. & Yuen, K.Y. Severe acute respiratory syndrome. Nat. Med. 10, S88–S97 (2004).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Al-Tawfiq, J.A. et al. Surveillance for emerging respiratory viruses. Lancet Infect. Dis. 14, 992–1000 (2014).
- He, B. et al. Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome–like coronavirus from bats in China. J. Virol. 88, 7070–7082 (2014).
- Article
- Google Scholar
- Li, F. Receptor recognition and cross-species infections of SARS coronavirus. Antiviral Res. 100, 246–254 (2013).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Sheahan, T. et al. Mechanisms of zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus host range expansion in human airway epithelium. J. Virol. 82, 2274–2285 (2008).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Yoshikawa, T. et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PLoS ONE 5, e8729 (2010).
- Qiu, X. et al. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp. Nature 514, 47–53 (2014).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Sui, J. et al. Broadening of neutralization activity to directly block a dominant antibody-driven SARS-coronavirus evolution pathway. PLoS Pathog. 4, e1000197 (2008).
- Sui, J. et al. Effects of human anti–spike protein receptor-binding domain antibodies on severe acute respiratory syndrome coronavirus neutralization escape and fitness. J. Virol. 88, 13769–13780 (2014).
- Article
- Google Scholar
- Rockx, B. et al. Escape from human monoclonal antibody neutralization effects in vitro and in vivo fitness of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Infect. Dis. 201, 946–955 (2010).
- Spruth, M. et al. A double-inactivated whole-virus candidate SARS coronavirus vaccine stimulates neutralizing and protective antibody responses. Vaccine 24, 652–661 (2006).
- Bolles, M. et al. A double-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine provides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilic proinflammatory pulmonary response upon challenge. J. Virol. 85, 12201–12215 (2011).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Siegrist, C.-A. in Vaccines 6th edn. (eds. Plotkin, S.A., Orenstein, W.A. & Offit, P.A.) 14–32 (W.B. Saunders, 2013).
- Deming, D. et al. Vaccine efficacy in senescent mice challenged with recombinant SARS-CoV bearing epidemic and zoonotic spike variants. PLoS Med. 3, e525 (2006).
- Graham, R.L., Donaldson, E.F. & Baric, R.S. A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 11, 836–848 (2013).
- CAS
- Article
- Google Scholar
- Graham, R.L. & Baric, R.S. Recombination, reservoirs and the modular spike: mechanisms of coronavirus cross-species transmission. J. Virol. 84, 3134–3146 (2010).
- Agnihothram, S. et al. A mouse model for betacoronavirus subgroup 2c using a bat coronavirus strain HKU5 variant. MBio 5, e00047-14 (2014).
- Relman, D.A. Metagenomics, infectious disease diagnostics and outbreak investigations: sequence first, ask questions later? J. Am. Med. Assoc. 309, 1531–1532 (2013).
- Kaiser, J. Moratorium on risky virology studies leaves work at 14 institutions in limbo. ScienceInsider http://news.sciencemag.org/biology/2014/11/moratorium-risky-virology-studies-leaves-work-14-institutions-limbo (2014).
Frieman, M. et al. Molecular determinants of severe acute respiratory syndrome coronavirus pathogenesis and virulence in young and aged mouse models of human disease. J. Virol. 86, 884–897 (2012).
Ren, W. et al. Difference in receptor usage between severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and SARS-like coronavirus of bat origin. J. Virol. 82, 1899–1907 (2008).
- CAS
- Article
- Google Scholar
Sims, A.C. et al. Release of severe acute respiratory syndrome coronavirus nuclear import block enhances host transcription in human lung cells. J. Virol. 87, 3885–3902 (2013).
Fulcher, M.L., Gabriel, S., Burns, K.A., Yankaskas, J.R. & Randell, S.H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183–206 (2005).
- Roberts, A. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 3, e5.
Acknowledgments
Research in this manuscript was supported by grants from the National Institute of Allergy & Infectious Disease and the National Institute of Aging of the US National Institutes of Health (NIH) under awards U19AI109761 (R.S.B.), U19AI107810 (R.S.B.), AI085524 (W.A.M.), F32AI102561 (V.D.M.) and K99AG049092 (V.D.M.), and by the National Natural Science Foundation of China awards 81290341 (Z.-L.S.) and 31470260 (X.-Y.G.), and by USAID-EPT-PREDICT funding from EcoHealth Alliance (Z.-L.S.). Human airway epithelial cultures were supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease of the NIH under award NIH DK065988 (S.H.R.). We also thank M.T. Ferris (Dept. of Genetics, University of North Carolina) for the reviewing of statistical approaches and C.T. Tseng (Dept. of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch) for providing Calu-3 cells. Experiments with the full-length and chimeric SHC014 recombinant viruses were initiated and performed before the GOF research funding pause and have since been reviewed and approved for continued study by the NIH. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the NIH.
Author information
Affiliations
- Department of Microbiology and Immunology, the University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
- Kari Debbink
- & Ralph S Baric
- Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China
- Xing-Yi Ge
- & Zhengli-Li Shi
- Department of Cell Biology and Physiology, the University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
- Scott H Randell
- Cystic Fibrosis Center, Marsico Lung Institute, the University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
- Scott H Randell
- Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona Institute of Microbiology, Zurich, Switzerland
- Antonio Lanzavecchia
- Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA
- Wayne A Marasco
- Department of Medicine, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA
- Wayne A Marasco
Contributions
V.D.M. designed, coordinated and performed experiments, completed the analysis and wrote the manuscript. B.L.Y. designed the infectious clone and recovered chimeric viruses; S.A. completed neutralization assays; L.E.G. helped perform mouse experiments; T.S. and J.A.P. completed mouse experiments and plaque assays; X.-Y.G. performed pseudotyping experiments; K.D. generated structural figures and predictions; E.F.D. generated phylogenetic analysis; R.L.G. completed RNA analysis; S.H.R. provided primary HAE cultures; A.L. and W.A.M. provided critical monoclonal antibody reagents; and Z.-L.S. provided SHC014 spike sequences and plasmids. R.S.B. designed experiments and wrote the manuscript.
Corresponding authors
Correspondence to Vineet D Menachery or Ralph S Baric.
Ethics declarations
Competing interests
The authors declare no competing financial interests.
Supplementary Text and Figures
Supplementary Figures 1–6 and Supplementary Tables 1–4 (PDF 4747 kb)
Reprints and Permissions
Cite this article
Menachery, V., Yount, B., Debbink, K. et al. A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med 21, 1508–1513 (2015). https://doi.org/10.1038/nm.3985
- Received
- Accepted
- Published
- Issue Date
Source: Free Download MP3 of OUT OF CONTROL on SoundCloud.com
TO SHARE THIS ARTICLE ON FACEBOOK, PLEASE COPY and PASTE this link: https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/
Sources:
- A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
- Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor
- Severe acute respiratory syndrome
- Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp
- A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses
Duff has traveled extensively, is published around the world and is a regular guest on TV and radio in more than “several” countries. He is also a trained chef, wine enthusiast, avid motorcyclist and gunsmith specializing in historical weapons and restoration. Business experience and interests are in energy and defense technology.
Gordon’s Archives – 2008-2014
Due to the nature of independent content, VT cannot guarantee content validity.
We ask you to Read Our Content Policy so a clear comprehension of VT's independent non-censored media is understood and given its proper place in the world of news, opinion and media.
All content is owned by author exclusively. Expressed opinions are NOT necessarily the views of VT, other authors, affiliates, advertisers, sponsors, partners or technicians. Some content may be satirical in nature. All images within are full responsibility of author and NOT VT.
About VT - Read Full Policy Notice - Comment Policy
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου
To μπλόκ " Στοχσμός-Πολιτική" είναι υπεύθυνο μόνο για τα δικά του σχόλια κι όχι για αυτά των αναγνωστών του...Eπίσης δεν υιοθετεί απόψεις από καταγγελίες και σχόλια αναγνωστών καθώς και άρθρα που το περιεχόμενο τους προέρχεται από άλλες σελίδες και αναδημοσιεύονται στον παρόντα ιστότοπο και ως εκ τούτου δεν φέρει οποιασδήποτε φύσεως ευθύνη.